12.lekcija - molekulārā bioloģija medicīnā

Gēla elektroforēze - 1

*Agarozes gēla ektroforēze: >Agaroze ir komplekss cukurs, izolēts no jūraszālēm. Gēlu veido cieši saistītas garas cukuru ķēdes. Polimerizējas atdziestot. >Gēla novietojums horizontāls. >Izšķirtspēja 50 - 30 000 bp (atkarībā no gēla koncentrācijas).

Medikamenti, ražoti biotehnoloģiskos procesos

*Antibiotikas *Asinsreces faktori *Hormoni *Citokīni *Augšanas faktori *Enzīmi *Vakcīnas

DNS izmaiņu specifiska vēža ārstēšana

*DNS izmaiņas somatiskajās šūnās: >Amplifikācija un pārekspresija FGFR2; VEGF/VEGFR; EGFR; HER-2 u.c. gēnos. >Alēliskie varianti kRAS; Raf; PI3K u.c. gēnos.

Biotehnoloģija - 1

*Dzīvo organismu vai bioloģisko procesu izmantošana, ar mērķi attīstīt pielietojamus lauksaimniecības, industriālos un medicīnas produktus, pielietojot tādas tehnikas kā ģenētiskā inženierija, kas ietver gēnu modifikācijas. *Medicīnas biotehnoloģijas, zināmas arī kā sarkanā biotehnoloģija, un strādā, lai attīstītu jaunas diagnostikas un terapijas metodes.

Rekombinantā insulīna ražošana

*E. coli ir izvēles organisms daudzu rekombinanto proteīnu ražōšanai. *Tomēr daudzas post-translācijas E. coli nenotiek.

LCHADD molekulārā diagnostika ar RFLP un elektroforēzi

*Garo ķēžu 3-hidroksiacil-Ko-A dehidrogenāzes deficīts (LCHADD; OMIM #609016): >Izraisa HADHA gēna alēliskie varianti. Gēns kodē garo ķēžu hidroksiacil-Ko-A dehidrogenāzi, kas katalizē taukskābju beta oksidācijas soli mitohondrijos. >Klīniskie simptomi - kardiomiopātija agrīnā vecumā, hipoglikēmija, neiropātija un pēkšņa nāve. >Biežākais alēliskais variants ir 1528G>C,kā rezultātā proteīna aminoskābju secības 510 pozīcijā Glu aizvieto Gln. Šis alēliskais variants izraisa enzīma aktivitātes zudumu bez enzīma kompleksa struktūras izmaiņām.

PCR modifikācijas - 2

*Kvantitatīvā PCR (qPCR) > Apvieno PCR rekcijas signāla noteikšanu un kvantifikāciju vienā solī. > Izmanto fluoroscentas iezīmes, lai spētu signālu noteikt amplifikācijas laikā > Iekārta mēra fluoroscentā signāla emisiju reakcijas eksponenciālās fāzes laikā

NGS ierobežojumi

*Lai arī izmaksas ir salīdzinoši lētākas laika un naudas izteiksmē salīdzinot ar Sangera sekvenēšanu, tomēr joprojām dārga metode nelielām laboratorijām. *Neprecīzs secības lasījums iespējams homopolimēru rajonos (atkārtojumu secības) dažām NGS platformām, kas var novest pie interpretācijas kļūdām. Diagnostikā nozīme kvalitātei! *Datu analīze ir ļoti laikietilpīga, prasa specifiskas zināšanas bioinformātikā.

CF ārstēšana - 2

*Lai atjaunotu jonu transportu p.Phe508del CFTR kanālā nepieciešama korektormolekula (Lumacaftor), kura neļauj degradēt nepareizas konformācijas proteīnu un palielina funkcionāla, mutēta proteīna ekspresiju. *Aktivātors (Ivacaftor) palīdz palielināt kanāla atvēršanos un lielākajā daļā III klases alēlisko variantu izmainītu proteīnu.

Jaunās paaudzes sekvenēšana (NGS)

*NGS nodrošina alternatīvu metodi ar par lētākām izmaksām un augstāku caurlaidību salīdzinot ar Sangera sekvenēšanu. *Šāda augstas caurlaidības metode nodrošina ar slimību saistītu gēnu un regulatoro elementu atklāšanu. *Mērķtiecīga sekvenēšana (gēnu paneļi) ļauj diagnosticēt slimību izraisošus alēliskos variantus saistītus ar specifiskiem simptomiem un patoloģiju. *Nodrošina <<dziļāku>> secības lasījumu.

Sangera (tiešā) sekvenēšana

*Nosaukta Freda Sangera vārdā, kurš kopā ar Valteru Gilbertu par šīs metodes izstrādi 1980. gadā saņēma Nobela prēmiju. *Metodi lieto, lai noteiktu nezināmas DNS secības fragmenta secību (līdz 800 - 900bp gara). PCR-> sekvenēšanas reakcija -> elektroforēze

Restrikcijas fragmentu garuma polimorfisms (RFLP)

*Pielieto tiešai alēlisko variantu analīzei (pielietojums var būt dažāds). *Restrikcijas enzīmi ir DNS molekulu šķeļoši baktēriju enzīmi. Enzīms atpazīst un šķeļ specifisku DNS nukleotīdu secību. PCR-> RFLP-> elektroforēze.

Cilvēka rekombinantais insulīns

*Pirmais licenzētais medikaments, kura ražošanā izmantota rekombinantā DNS tehnoloģija, bija cilvēka insulīns. To attīstīja kompānija Genentech 1982. gadā. *Pārsvarā rekombinato cilvēka insulīnu ražo izmantojot E. coli and Saccharomyces cerevisiae.

Gēla elektroforēze - 2

*Poliakrilamīda gēla elektroforēze (PAG): >PAG veido ķīmiskas saites starp akrilamīdu un bis- akrilamīdu. >Gēla novietojums vertikāls. >Augsta izšķirtspēja īsiem DNS fragmentiem no 5 -500bp.

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR)

*Polimerāzes ķēdes reakcija plaši tiek lietota DNS rajona, ar zināmu secību, pavairošanai. *Pamata metode molekulārajā bioloģijā.

PCR modifikācijas - 1

*Reversās transkripcijas PCR (RT-PCR): >metode mRNS noteikšanai un kvantificēšanai.

Cilvēka insulīns

*Sintezēts kā viens polipeptīds - preproinsulīns aizkuņģa dziedzera beta šūnās. *Preproinsulīnam ir 24-AS atlikumu signālpeptīds, kurš kalpo kā signāls polipeptīda transportam uz ET. *Pēc transporta signālpeptīds tiek atšķelts un veidojas proinsulīns. * ET notiek polipeptīda procesēšana veidojot tā konformāciju ar 3 disulfīdsaitēm. *Konformāciju ieguvušais proinsulīns tiek transportēts uz trans-Goldži aparātu, kur iegūst aktīva insulīna formu iedarbojoties endopeptidāzēm.

Vēža mērķterapija:

*Terapeitiskās monoklonās antivielas - mērķis ir specifiski šūnas virsmas antigēni, kā transmembranālie receptori vai ekstracelulārie augšanas faktori. *Mazas molekulas - spēj šķērsot šūnas membrānu un mijiedarboties ar terapijas mērķi šūnā. Mazas molekulas spēj iedarboties uz mērķproteīnu enzimātisko aktivitāti.

PCR pielietojums

*Ģenētiskie pētījumi, *Medicīna - diagnostika, *Mikrobioloģija un virusoloģija, *Mikoloģija un parazitoloģija, *Tiesu medicīna, *Vides zinātnes.

CF diagnostika ar PCR un elektroforēzi

Cistisko fibrozi (CF; MIM #219700) izraisa CFTR gēna alēliski varianti. Pasaulē un arī Latvijā biežākais ir p.Phe508del, novēro vidēji 75% CF slimnieku. p.Phe508del alēliskais variants ir 3 nt delēcija (rāmja) kura rezultātā proteīna 508 aminoskābes pozīcijā ir zaudēts Phe.

Omika....

Genomika - DNS Transkriptomika - mRNS Proteomicsa - proteīni Metabolomika - metabolīti (aminoskābes, organiskās skābes, ogļhidrāti u.c.)

Biotehnoloģija - 2

Pašreizējie biotehnoloģiskie procesi aptver piecas dažādas organismu grupas: *baktērijas (piem. Escherichia coli) *raugus (piem. Saccharomyces cerevisiae) *augus (piem. tabaka) *kukaiņi (piem. Spodoptra frugiperda) *zīdītāji (piem. ķīnas kāmja olnīcu šūnas(CHO), aknu šūnas (BHK) un transgēnos dzīvniekus)

Molekulārā medicīna

Zinātne, kas izzina slimības iemeslus un mehānismus molekulārā līmenī, pielieto šīs zināšanas slimības profilaksē, diagnostikā un ārstēšanā.

CF ārstēšana - 1

p.Phe508del alēliskais variants Delēcijas rezultātā veidojas proteīns ar daļēji nepareizu konformāciju. Tas tiek aizturēts ET un tad degradēts iesaistoties proteosomām. *Korektormolekula palielina p.Phe508del CFTR kanāla proteīna ekspresiju membrānā.

Personalizētā (precision) medicīna

«attiecas uz medicīniskās aprūpes pielāgošanu katra pacienta individuālajām īpašībām. ......... spēja klasificēt indivīdus subpopulācijās, kas atšķiras atkarībā no viņu jutības pret konkrētu slimību vai to reakciju uz īpašu ārstēšanu. Profilaktiska vai terapeitiska iejaukšanās tad var koncentrēties uz tiem, kas no tās gūs labumu, samazinot izdevumus un blakusparādības tiem, kas labumu negūs.»