41. Desarrollo embrionario precoz

a) Cómo se analiza el ADN en el DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIÓN

-En PGD se emplea PCR (reacción en cadena de la polimerasa): la PCR es una técnica que permite obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo (en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original). Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación resulta mucho más fácil estudiar el ADN seleccionado. Para llevar a cabo esta técnica se somete al ADN a altas temperaturas para que se desnaturalice y se separen las dos hebras, luego se usan ADN polimerasas para que repliquen las hebras y se baja la temperatura para que las hebras vuelvan a unirse. El proceso se repite muchas veces hasta obtener suficiente ADN. En el PGD cada uno de los genes-prueba se pueden amplificar y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.

• Regulación DE LOS BLASTOCISTOS

- En este estadío el embrión es altamente regulable porque se puede dividir por la mitad, en cuyo caso dará lugar a gemelos, o se puede combinar y dará lugar a "quimeras". - La regulación es la capacidad del embrión de producir una estructura normal aunque se le hayan quitado o añadido partes. - La técnica experimental más sencilla de las que se usan para demostrar las propiedades reguladoras de los embriones precoces es separar los blastómeros de los embriones al comienzo de la segmentación y determinar si cada uno de ellos puede dar lugar a un embrión completo. - Este método se ha usado para demostrar que los blastómeros únicos de embriones de dos, y en ocasiones hasta de cuatro células pueden formar embriones normales, aunque los blastómeros de etapas posteriores no pueden hacerlo. - Si se toma una sola célula de un embrión al comienzo de la etapa de segmentación y se inyecta en el blastocele de un huésped diferente desde el punto de vista genético estas células se incorporan al embrión huésped y dan lugar a quimeras o mosaicos celulares. (*Como curiosidad: mediante diversos métodos para hacer embriones quiméricos, es posible incluso combinar blastómeros para producir quimeras entre especies, por ejemplo, una cabra-oveja).

a) Factores que intervienen en la implantación embrionaria

- La maduración del blastocisto, ya que éste debe ser capaz de romper la zona pelúcida (eclosión del embrión) para poder implantarse. -La preparación del endometrio para la implantación. En el momento de la implantación, la mucosa del útero se encuentra en la fase secretora y por la acción de la hormona progesterona (producida por el cuerpo lúteo), tiene lugar la decidualización (hipertrofia de las células del endometrio, que contienen grandes reservas de glucógeno). A medida que el blastocisto se implanta en el útero decidualizado tiene lugar la reacción decidual, en la cual los vasos sanguíneos se dilatan y aumenta la permeabilidad de los capilares. -En la implantación del embrión intervienen moléculas como las que intervendrían en muchas otras uniones entre células, las moléculas de adhesión (integrinas específicas). La superficie de las células epiteliales del endometrio expresan integrinas en sus superficies, y las células trofoblásticas del blastocisto también expresan integrinas en sus superficies. -La apoptosis regulada de las células del epitelio endometrial también facilita la invasión. -Además, tres citocinas parecen estar involucradas en la implantación: el factor estimulante de colonias I, el factor inhibidor de la leucemia y la interleucina I. Se ha propuesto que las modificaciones en la inmunidad materna durante el embarazo tienen lugar debido a un cambio en el equilibrio de las citocinas que favorece la producción de anticuerpos e inhibe las respuestas mediadas por células, cuya capacidad de provocar daño es superior.

a) Cómo se analiza el ADN en el screening genético preimplantacional (PGS)

-En PGS se emplea FISH (hibridación fluorescente in situ): es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así como de las anomalías que puedan presentar. Permite la rápida detección de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, etc. En esta técnica, se desnaturaliza el ADN para separar la doble hélice. A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés (fragmento de ADN cuyas bases conocemos marcado fluorescentemente). Las sondas hibridan a las regiones específicas para las que han sido diseñadas. Las sondas de ADN pueden marcarse con moléculas fluorescentes o con moléculas no fluorescentes que se detectan luego con anticuerpos fluorescentes. Por último, se visualiza la muestra con un microscopio de fluorescencia.

b) En qué casos se realiza

-Para ayudar a la reproducción: el seleccionar embriones más adecuados puede ayudar a mujeres de avanzada edad, con problemas de esterilidad o infertilidad por otras causas (abortos de repetición de causa desconocida, fallos de implantación) a llevar un embarazo a término. -Se lleva a cabo cuando alguno de los progenitores es portador de una anomalía cromosómica, para evitar así el nacimiento de niños con enfermedades (aneuploidías, enfermedades monogénicas...), sobre todo cuando ya ha habido hijos anteriores que han nacido con una enfermedad de este tipo. -Cuando el varón tiene el seminograma alterado. -Para seleccionar embriones que sean compatibles con un hermano que padezca una enfermedad, y poder así hacer transplantes (tipaje genético).

B. MÓRULA

Al finalizar la segmentación aparece la mórula de 16 células (día 3). La mórula consiste en un pequeño grupo de células internas (masa celular interna) rodeadas por un grupo más grande de células externas (masa celular externa). Como ya hemos visto, las células de la masa celular interna se unen por uniones tipo gap, lo que permite la difusión de sustancias de bajo peso molecular entre ellas, mientras que las células de la masa celular externa se unen por desmosomas y uniones estrechas, que forman un sello impermeable entre el interior y el exterior del embrión. La mayoría de las células descendientes de las células externas se convierten en las células del trofoblasto. Este grupo de células no produce estructuras embrionarias: forma el tejido del corion, la porción embrionaria de la placenta. Las células descendientes de la masa celular interna, por su parte, darán lugar al embrioblasto, a partir del cual se formará el embrión.

C. FORMACIÓN DE LOS BLASTOCISTOS (BLASTOGÉNESIS)

El blastocisto es la estructura que sigue a la mórula. Para que se forme, las blastómeras de la parte externa fabrican bombas de Na-K que bombean sodio al interior del embrión. Ese sodio arrastra agua, y esta agua empieza a formar una cavidad entre las células, dando lugar al blastocisto. La cavidad, que recibe el nombre de blastocele, se va haciendo cada vez más grande. Esto empieza a ocurrir aproximadamente en el momento en que la mórula entra en la cavidad uterina. En este momento (pasado el día 5) el embrión es un blastocisto. Las células de la masa celular interna, ahora llamada embrioblasto, se encuentran en un polo, mientras que las células de la masa celular externa o trofoblasto, se aplanan y forman la pared epitelial del blastocisto. En este punto, la zona pelúcida va a desaparecer; esto es necesario para la que se produzca la implantación. Mientras el embrión se está moviendo a través de la trompa de Falopio la zona pelúcida es necesaria porque evita que el blastocisto se adhiera a las paredes de la trompa de Falopio. Cuando tales adherencias tienen lugar se produce un embarazo ectópico tubárico. Sin embargo, cuando el embrión alcanza el útero debe "eclosionar" para poder adherirse a la pared uterina. La eclosión tiene lugar en el 6º día del desarrollo.

c) Tolerancia inmunológica

En el momento de la implantación, el embrión es una estructura extraña para la madre, de modo que su organismo lo rechazaría si no hubiera ningún mecanismo para impedirlo. Por ello, el trofoblasto carece de compejo mayor de histocompatibilidad y además tiene algunos enzimas que hacen que no actúen los linfocitos T. Se trata de un enzima que catalizadora del triptófano, un aminoácido esencial para los linfocitos, con lo que se crea una zona libre de linfocitos T.

3. DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIÓN

Es una técnica de detección de anomalías genéticas en el embrión previa a la transferenica en el útero materno. El proceso es el siguiente: la mujer se somete a un tratamiento hormonal para estimular la ovulación; a continuación los óvulos se extraen a través de la vagina. Del varón se recoge una muestra de semen y en el laboratorio se fecundan los óvulos. Mediante un análisis de las células del embrión cultivadas, se evalúa la constitución de los cromosomas y se diferencia los sanos de los enfermos. La célula para el análisis se suele obtener del embrión de 8 células, y se extrae aspirándola con una pipeta. Es decir, se hace una biopsia embrionaria cuando las células aún son totipotentes y se estudia. Se hace en el estadío de mórula o blastocisto temprano; antes de la implantación pero lo suficientemente tarde como para saber que el proceso de división no se va a detener (como ocurre en casi la mitad de los casos). Finalmente, se transfieren al útero los embriones sanos. Debemos distinguir entre el diagnóstico genético preimplantacional en sí (PGD) y el screening genético preimplantacional (PGS). El primero es el diagnóstico del genotipo del embrión respecto a la presencia o no de un alelo causante de enfermedad o una alteración cromosómica, mientras que el segundo es la selección de los embriones cromosómicamente normales para su implantación.

1. FERTILIZACIÓN, PRIMERAS DIVISIONES E IMPLANTACIÓN A. SEGMENTACIÓN

La primera división es muy lenta y tiene lugar aproximadamente 32 horas después de la fecundación. Una vez que el cigoto ha llegado a la fase de dos células, experimenta una serie de divisiones mitóticas más rápidas que aumentan el número de células. Éstas, cuyo tamaño se reduce con cada división, reciben el nombre de blastómeras. Las blastómeras se dividen por la mitad y a la vez. Mientras tiene lugar la segmentación, el embrión está siendo desplazado hacia el útero por la acción de los cilios de las paredes de la trompa de Falopio. En el proceso de división de las blastómeras está alterado el ciclo celular. En una célula blastómera no hay fases G1 y G2, de manera que pasa de mitosis a síntesis y de síntesis a mitosis. Este es el motivo de que cada división origine dos células cuyo tamaño es la mitad del de la célula anterior. El embrión va a estar rodeado por la zona pelúcida hasta el momento de la implantación. Y como han de caber en el mismo espacio, con cada división las células se hacen más pequeñas. Además, después de la tercera división maximizan el contacto entre ellas y forman una pelota compacta. En el estado no compactado se pueden distinguir las líneas que delimitan cada blastómero, mientras que en el compactado el contacto entre las células el máximo y las líneas que delimitan las células ya son difíciles de distinguir. La compactación se debe a que en el estadío de 8 células se empiezan a expresar proteínas de adhesión celular como la cadherina-E y por ello las blastómeras se agrupan y forman una esfera compacta. Esta organización firmemente empaquetada es estabilizada por las uniones estrechas y desmosomas, que se forman entre las células exteriores de la esfera y sellan el interior de la misma. Las células de dentro de la esfera forman uniones GAP o en hendidura, permitiendo de este modo el paso entre ellas de pequeñas moléculas e iones. Las células externas además desarrollan pequeñas vellosidades por fuera. Como vemos, en este estadío tan temprano empezamos a tener diferenciaciones celulares en forma de uniones celulares, de modo que en el futuro las células internas van a formar la masa celular interna (que dará lugar al embrioblasto en el blastocisto) y las externas, la masa celular externa (que dará lugar al trofoblasto). Aunque la diferenciación es temprana si separamos una célula sigue siendo totipotente. La omisión de las fases G1 y G2 tiene otra consecuencia, y es que se van a eliminar también los puntos de control, por lo que se van a producir divisiones anómalas con frecuencia (es por ello que aproximadamente el 50% de los embriones no llegan a nacer).

D. IMPLANTACIÓN, proceso.

b) Proceso: Hacia el día 8, las células trofoblásticas del polo embrionario empiezan a penetrar entre las células de la mucosa uterina. En el proceso de implantación, el embrión va a "excavar" en la pared epitelial del endometrio mediante el uso de enzimas que rompen las uniones entre las células, principalmente proteasas. Al establecer contacto con los tejidos maternos, las células trofoblásticas proliferan rápidamente y erosionan la mucosa uterina (recordemos, además, que se diferencian en citotrofoblasto y sincitiotrofoblasto). El embrión se introduce por completo en el endometrio y se sella la entrada, como si se tratase de una herida que cicatriza. Hacia el día 11-12 después de la fecundación, el embrión ya se ha introducido totalmente en la mucosa uterina. Después, las células de la masa celular interna se empiezan a diferenciar para formar un embrioblasto de 2 hojas y en la tercera semana aparece la tercera hoja. A partir de estas 3 hojas se van a formar todos los tejidos que componen el organismo. El sitio normal de implantación es el cuerpo uterino (parte posterior y superior de la cavidad uterina). Si se implanta en el segmento inferior habrá una placenta previa. Si se implanta en otros lugares tendremos un embarazo ectópico. Este puede darse en el ovario, fuera de la trompa entre las asas intestinales, en la trompa (la cual no se puede hipertrofiar y acaba por romperse), en el fondo del saco de Douglas (pliegue entre el recto y el útero), etc.

2. EXPRESIÓN GÉNICA Y METABOLISMO

• Metabólicamente, el embrión va a tardar casi hasta el estadío de 8 células (3 días) para empezar a expresar su propio genoma (transcripción) y fabricar proteínas propias, de manera que antes de eso las proteínas que usa dependen del genoma materno. El período de 8 células (estado donde ya existen distintas comunicaciones celulares) coincide con el momento de expresión de genes y proteínas nuevas que vemos en las conexiones celulares. Es un estadío crítico. Aquí es donde se bloquean la mayor parte de los embriones. Casi la mitad de los embriones se detienen en estos estadíos tempranos generalmente porque las primeras divisiones han sido anómalas. Eso provoca que cuando el embrión necesita utilizar su propio ADN para la síntesis de algunas proteínas, no lo pueda utilizar. • Para ir hasta el útero necesita nutrientes, que en inicio se los proveen las células de la granulosa. Los nutrientes difunden a través de la zona pelúcida. Las células de la granulosa proporcionan al embrión piruvato hasta el estadío de 8 células. Además, el embrión recibe una dote materna de material vitelino que es suficiente en las primeras divisiones, cuando aún no hay síntesis proteica propia. De 8 células en adelante cambian las necesidades nutricias y empieza a requerir glucosa, por lo que tiene que empezar a sintetizarla. También cambia los aminoácidos; a partir del día 8 empieza a emplear aminoácidos esenciales además de los no esenciales que empleaba antes.