Génétique: génie génétique

Différentes thérapies géniques

- expression d'un gène sain dans une cellule malade (mucoviscidose) - thérapie génique (on transforme une cellule par un virus modifié) - thérapie génique CRISPR (=correction d'un gène sur le chromosome)

2 méthodes qui permettent de localiser un fragment d'ADN précis dans une banque de gènes

- hybridisation du filtre - dénaturation et hybridisation

Quels sont les différentes applications de la génomique?

- identifications d'individus - thérapie génétique - diagnostic prénatal - animaux transgéniques - clonage de tissus et d'organismes

Quels sont les 5 procédés utilisés en génomique pour séquence le génome humain?

- séquençage par Cinger - séquençage automatique - next generation sequencing (second generation) - next generation sequencing (troisième génération, nanopore)

Comment formé un ADN recombinant?

1. Le fragment d'ADN est coupé par une enzyme de restriction 2. Le fragment entre dans un brin d'ADN complémentaire 3. La ligase lie les fragments étrangers aux fragments d'ADN => Brin d'ADN recombinant Le brin est présent en toutes petites quantités il faut donc encore l'amplifier avec des plasmides.

Processus de création d'une banque de cDNA

1. On ajoute le mRNA dans une matrice qui séparera les queues polyA, les tRNA et rRNA du reste de la molécule. => ne reste que le mRNA 2. on procède à une réplication du brin d'ARN en ADN grâce à l'enzyme reverse transcriptase. 3. L'ARNm initial est détruit (sauf quelques amorces) et un deuxième brin d'ADN est synthétisé par l'ADN polymérase. 4. La ligase relie les fragment d'ADN complémentaire entre eux => nouveau double brin d'ADN à partir du brin d'ARNm épissé 5. On met l'ADN dans un plasmide pour qu'il l'augmente => colonie pour la banque d'ADN

Processus de clonage d'un mammifère

1. On bloque des cellules d'un mouton en culture en phase G0 et on en prélève une. 2. On prélève un ovule d'une autre moutone et on lui enlève le noyau => ne contient plus d'info génétique. 3. Fusion des deux cellules 4. Mise en culture pour que ça forme un zygote 5. Implantation du zygote dans une mère porteuse 6. Naissance d'un mouton avec la même identité (=même ADN) que le donneur.

Comment amplifier des fragments d'ADN en laboratoire?

1. On récupère un plasmide d'une cellule bactérienne et on le modifie pour le rendre apte au clonage 2. On lui insère un fragment d'ADN étranger => le plasmide revient une molécule d'ADN recombiné 3. On replace le plasmide dans une autre bactérie => recombinant bactérien

Combien de gènes chez l'homme?

20'000

Pourquoi est-ce que le mouton cloné (Dolly) vieillit-il plus vite?

Car il a reçu des chromosomes déjà âgés dont les télomères étaient usés. Comme il n'y a pas de réparation des télomères dans les cellules somatiques, les cellules de Dolly meurent rapidement.

Qu'est ce que Cas9? Qu'est ce que sgRNA?

Cas9: Une endonucléase (enzyme spécialisée dans le découpage de l'ADN) sgRNA: single-guide RNA. reconnaît spécifiquement une séquence qui sera alors clivée par Cas9

Qu'est ce qu'un plasmide?

Ce sont des minichromosomes circulaires qui sont capables de réplication autonome et ne sont pas essentiels à la vie cellulaire. Ils peuvent se répliquer, contiennent un gène de résistance et on en trouve plusieurs copies dans un ADN => idéaux pour amplifier les fragments d'ADN

Rôle des enzymes de restriction

Couper l'ADN à des endroits précis. Chaque enzyme reconnait une séquence particulière qu'elle va couper. Produites par des bactéries. Elles permettent de cliver l'ADN étranger

Processus de dénaturation et d'hybridation

Dénaturation= séparation de 2 brins d'ADN complémentaire (par une enzyme, des conditions extrêmes...) Hybridisation= ajout d'une sonde complémentaire dans les brins d'ADN dénaturés (=seuls) qui se lie à l'ADN correspondant. SI cette sonde est marquée avec un fluorescent on peut localiser le segment d'ADN précis.

Intérêt des cellules souches

Elles ne sont pas différenciées et peuvent devenir n'importe quel tissu en fonction des facteurs de croissance que l'on ajoute. => on peut créer des tissus in vitro pour remplacer des organes détruits par des maladies dégénératives pas exemple.

Comment fonctionne l'identification d'individu par une enzyme de restriction?

L'enzyme de restriction va couper les 2 allèles de manière différente (vu que les séquences sont différentes en cas de polymorphisme). On obtient donc différents fragments que l'on peut identifier par électrophorèse. Cette méthode est utile pour déterminer la présence ou non d'un gène chez une personne ou pour les test d'identité moléculaire (criminologie).

Quel est l'effet de l'ajout d'un gène SRY dans un embryon XX?

L'individu, bien que de génotype XX, possède des organes sexuels masculins! => le gène SRY est suffisant pour la formation de gonades masculines

Principe du séquençage next génération (nanopore)

La molécule d'ADN dénaturée passe dans un nanopore en même temps d'un flux ionique. Chaque base engendre une perturbation typique du flux ionique qui peut être lue.

Quelles sont les méthodes génétiques tentées contre la mucoviscidose?

La mucoviscidose étant causée par un canal au chlore défectueux, on tente d'introduire le gène sain codant pour un canal fonctionnel dans les cellules malades. celle-ci pourra alors exprimer un canal fonctionnel. Le problème c'est que les cellules sont renouvellées régulièrement et il faudrait donc réintroduire régulièrement de l'ADN sain dans les cellules malades = contraignant et coûteux.

Qu'est ce que le polymorphisme?

La propriété qu'ont les individus d'une espèce de se présenter sous plusieurs formes différentes. Le polymorphisme génétique (coexistence de plusieurs allèles dans une même espèce) créé des caractères phénotypiques différents.

Génie génétique définition

Manipulation du matériel génétique

Principe de la théorie génique

Mettre le gène sain dans un virus et faire que le virus infecte le patient. Attention il faut mettre les cellules malades en culture quelques temps avant de les insérer dans l'organisme. On ne peut PAS donner des cellules saines d'un autre patient sinon réponse immunitaire.

Qu'est ce qu'une banque de gène de cDNA?

Ne stocke que les gènes qui sont exprimés (on procède par copie du mRNA)

Comment peut-t'on exprimer une protéine recombinante dans le lait?

On ajoute dans le zygote avant la fusion des noyaux un gène codant pour une protéine humaine voulue = YFG (your favourite gene) avec son promoteur actif. On implante le zygote dans une mère porteuse. Le petit devrait posséder le gène. On contrôle dans le lait si la protéine est présente. Pas encore très au point pour le moment...

Principe du séquençage par Cinger

On connaît la séquence de l'amorce de l'ADN uniquement. On fait des essais en liant des ADN simple brin dont on connaît la terminaison et qui portent un ddNTP (nucléotide modifié) qui met fin à la croissance du brin d'ADN. ON peut ensuite lire les ADN qui ont été synthétisés et en déduire la séquence de l'ADN initial qui est complémentaire.

Processus d'hybridisation sur filtre

On dispose tous les types de cellules clones sur une membrane ON cribble la membrane avec une sonde marquée qui contient la séquence complémentaire au gène recherché. => la sonde se collera spécifiquement à la molécule de DNA souhaitée

Comment créé-t'on des souris transgéniques?

On injecte un gène dans un des deux noyaux du zygote (donc juste avant qu'ils ne fusionnent) On implante les embryons dans une mère porteuse puis on analyse le génome des souriceaux pour savoir lesquels possèdent le gène.

A quoi sert l'hybridation sur filtre?

Permet d'identifier quelle colonie contient le gène que l'on recherche.

Principe de l'analyse de restriction par buvardadge (Southern blot)

Permet de détecter des séquences d'acide nucléique particulières dans une échantillon complexe d'ADN. 1. une enzyme de restriction coupe l'ADN en fragments. 2. on fait une électrophones pour séparer les fragments par taille. 3. on fait diffuser une solution tampon à travers le gel. Elle va chercher à atteindre une membrane qui se trouve sous un papier buvard. La solution tampon traverse la gélatine et emporte avec elle l'ADN qui va rester coincé dans la membrane en nitrocellulose. 4. La membrane de nitrocellulose est mise en présence d'une solution contenant une sonde => liaison par appariement, on peut détecter les fragments complémentaires à la sonde.

Principe du séquençage next génération (second)

Permet de synthétiser des millions de fragments d'ADN en parallèle par détection des nucléotides incorporés

Processus du diagnostic prénatal et quand est-elle utilisée?

Si la famille présente une maladie héréditaire liée au chromosome Y on peut faire le diagnostic avant l'implantation in vitro. On prélève une cellule du zygote que l'on fragmente et amplifie. Ensuite on procède par électrophorèse pour voir s'il y a un chromosome Y

QU'est ce qu'un animal transgénique?

Un animal avec un gène en plus

Qu'est ce qu'une banque de gènes?

Un ensemble de colonies de bactéries contenant des gènes différents

Qu'est ce qu'une banque de gène génomique?

Une colonie qui contient des morceaux du génome. Fragments différents dans les différentes bactéries. => on peut amplifier certains gènes de manière ciblée

Qu'est ce que la transformation par électroporation?

Une méthode pour amplifier l'ADN 1. Un choc électrique provoque l'ouverture des pores des la cellule => l'ADN y entre 2. L'ADN est incorporé aux cellules et croît => formation de cellules recombinantes qui peuvent vivre dans un milieu sélectif (si on leur a injecté un gène de résistance par exemple)

Qu'est ce que la réaction de polymérase en chaîne?

Une méthode qui permet d'amplifier l'ADN en enchaînant des cycles dénaturation-hybridisation-complémentarité (synthétisation de l'ADN par Taq). Si la source d'ADN est peu abondante ou impure c'est une bonne méthode. => permet l'amplification in vitro de n'importe quel segment spécifique d'une ou de plusieurs molécules d'ADN. Augmentation exponentielle.

Qu'est ce qu'une carte de restriction?

Une représentation de l'ADN qui nous dit les endroits où il est coupé par les enzymes de restriction.

Qu'est ce que Taq?

enzyme particulière qui fonctionne à 72°C et est utilisée pour les dénaturation car elle survit à des températures élevées (95°C pour dénaturer)

Principe de l'électrophorèse d'acides nucléiques

ça permet de sépare des acides nucléiques selon leur taille, leur charge électrique au autre propriétés physiques. 1. On place les ADN sur un gel qui est soumis à une différence de potentiel: le haut est négatif et le bas est positif. 2. Comme l'ADN est chargé négativement, il va migrer vers le bas de la gélatine. La gélatine s'oppose plus au déplacement des grandes molécules que des petites => séparation selon la taille. 3. On sépare le mélange par bandes qui possèdent toutes des acides de même longueur