Tema 5: Protoplastos vegetales. Hibridación somática.

Métodos de selección de híbridos somáticos

1) Aislamiento directo. Al verse la fusión por microscopio, se aisla directamente con un micromanipulador o micropipeta. Es difícil el cultivo posterior, los híbridos somáticos aislados son difíciles de cultivar y necesitan el método nodriza o el cultivo en microgota. 2) Método visual. Los heterocariontes pueden distinguirse a veces a simple vista, como en el caso de los sin y con clorofila (hebras citoplasmáticas cuando sin y cloroplastos cuando con). 3) Citometría de flujo. Se colorean los dos tipos de parentales con colorantes fluorescentes y se seleccionan por un citómetro de flujo continuo los que tengan los dos tipos de colorante. 4) Separación sobre la base de características físicas. Son bastante sofisticados: - Distinguir carga eléctrica del híbrido y la de cada uno de los dos participantes en fusión. - Diferente efecto de centrifugación sobre el híbrido en comparación con el que se obtiene en protoplastos parentales. 5) Complementación genética en los híbridos. Posee características intermedias entre los parentales o carece de las deficiencias mostradas por los participantes en la fusión. - Selección de híbrido resistente a dos productos químicos, no solo a uno (de cada parental). - Híbridos somáticos autótrofos para auxinas, mientras que los de partida las necesitaban para crecimiento y división. 6) Selección por heterosis. Crecimiento más vigoroso. 7) Uso de inhibidores metabólicos. Protoplastos de cada uno de los parentales se tratan con inhibidor bioquímico irreversible, como yodoacetato o dietilpirocarbamato. Solo protoplastos híbridos pueden seguir creciendo y desarrollando paredes.

Medios de cultivo: composición

1) Altas cantidades de N, en forma de nitratos y aminoácidos (Gly, Arg, Glu y Asn). 2) Sacarosa/glucosa al 2-3%. 3) Ca y microelementos Fe, I, Mn, Zn, Mo, Cu y Co (equilibrados). 4) Ácidos orgánicos cítrico, málico y fumárico mejoran viabilidad y crecimiento de protoplastos. 5) Una o más auxinas y una o dos citoquininas paradivisión y crecimiento. Pocos protoplastos crecen bien sin reguladores del crecimiento. 6) Iniciada la división, se estimula la formación de callo elevando auxina/citoquinina y se adicionan ácido giberélico y vitaminas para favorecer la morfogénesis. 7) Medios para regeneración: sulfato de adenina.

Fusógenos físicos: electrofusión

1) Aplicación a protoplastos en suspensión de un campo eléctrico alternante, que genera dielectroforesis. 2) Dielectroforesis: Polariza la carga superficial de los protoplastos, se comportan como dipolos y emigran a las zonas de mayor intensidad. 3) Durante esta migración, contactan unos con otros formando cadenas paralelas a las líneas del campo aplicado. 4) Posteriormente, se aplica uno o dos pulsos de corriente de alta intesidad y corta duración. Esto degrada las membranas celulares y produce fusiones de protoplastos. 5) Aplicando adecuadamente, se puede conseguir el 60-80% de fusiones. Ventaja: se evitan condiciones fisiológicas negativas del PGE o el elevado pH del medio.

Aplicaciones de la fusión de protoplastos

1) Creación de híbridos que no serían posibles con cruzamientos normales, por barreras taxonómicas u otras causas (alopoliploides). 2) Si se puede obtener el híbrido por vía sexual no es una ventaja especial, los productos son difíciles de regenerar y las plantas obtenidas suelen ser estériles (sobre todo en especies muy alejadas o incompatibles). 3) Transferencia parcial de genoma. Mediante fusión de un protoplasto irradiado (donante) a un protoplasto receptor, se pueden producir plantas híbridas asimétricas, en las que sólo se ha transferido una porción del genoma y que presentan modificaciones fenotípicas con respecto a las parentales, como la falta de expresión de determinadas isoenzimas o sistemas enzimáticos. 4) Permite producir híbridos a partir de plantas subletales, con órganos masculinos anormales o con esterilidad masculina completa. 5) Hibridación entre plantas que aún están en estado juvenil y entre plantas adultas (leñosas de crecimiento lento). 6) Producción de cíbridos (cibridación). Con la reproducción sexual, el gameto masculino aporta a su descendencia exclusivamente el núcleo (cromosomas). En la somática, se aportan tanto el núcleo y citoplasma = cíbrido. Se puede transmitir información del citoplasma del parental masculino, como esterilidad masculina o resistencia a enfermedades/herbicidas. 7) Introgresión de genes silvestres en las especies cultivados. Por hibridación asimétrica o cibridación cuando los genes están en mitocondrias o cloroplastos. 8) Ventajas frente a ingeniería genética. No se necesita un conocimiento detallado del genoma ni de los mecanismos moleculares que determinan la expresión de dichos caracteres. Por el contrario, la transformación genética requiere la previa identificación y aislamiento de los genes que determinan la expresión del carácter de interés. 9) Transferencia de genes de herencia cuantitativa. Caracteres poligénicos como productividad, resistencia a estreses abióticos, resistencia horizontal a enfermedades... No se pueden transferir por transformación genética.

Cultivo: factores fisicoquímicos

1) Cultivo iniciado en oscuridad o bajo luz débil durante unos pocos días, después se transfiere a 0'4-2 W/m2. 2) Luz. Es un factor importante (división del protoplasto + inducción de polaridad). 3) Temperatura. 20-28ºC, especies de climas cálidos crecen bien a temperaturas más altas. 4) pH: 5'5-5'9.

Desventajas y problemas de la hibridación somática

1) Falta de un sistema de selección eficaz de los protoplastos fusionados. 2) Híbridos desequilibrados (estériles, malformados, inestables) y no viables, especialmente si hay distancia taxonómica. 3) Desarrollo de callos con quimeras. Cuando no hay fusión de núcleos cuando hay fusión de protoplastos, se dividen los núcleos de forma independiente. 4) Híbridos muy variables, debido a: I) Eliminación de cromosomas durante divisiones celulares, núcleos incompatibles (especies taxonómicamente alejadas). Se forman aneuploides poco viables. Se suele retener cromosomas de parental con ciclo celular más corto (por estudiar). II) Translocaciones cromosómicas. III) Incidencia de variación somaclonal. IV) Segregación de orgánulos, después de la fusión de dos citoplasmas tiene lugar una eliminación de plastidios y una recombinación de mitocondrias, que puede provocar la aparición de cíbridos con características no deseables.

Protoplastos: material vegetal

1) Mesófilo de la hoja. - Se esteriliza la hoja con hipoclorito cálcico del 7% durante 10 min, se lava 3 veces durante 5 min en agua destilada estéril y se separa epidermis inferior o se hacen cortes muy delgados. - Solución preplasmolizante de misma osmolaridad que solución de enzimas, con sales del medio de cultivo y un agente osmótico (manitol o sorbitol) durante una hora antes de la incubación enzimática. - L-arginina y L-lisina se añaden para reducir senescencia y estimular síntesis de macromoléculas que aumentan su viabilidad. 2) Callos y células en suspensión. - Se debe subcultivar cada 3-8 días, para reducir las células viejas y muertas en el cultivo. - Mayor viabilidad y rendimiento si se usan cultivos en fase exponencial temprana de ciclo de crecimiento tras ser subcultivados (paredes celulares más finas). 3) Otro material. Ápices de tallo, plántulas in vitro, cotiledones o hipocótilos. Método similar a mesófilo.

Protoplastos como sistema experimental (aplicación)

1) Modificación genética, se puede introducir material genético más fácilmente sin pared. 2) Fusión para producir híbridos somáticos. 3) Estudios de membrana, el plasmalema está directamente expuesto al medio de cultivo. 4) Clonación de líneas celulares interesantes. 5) Estudios de captación y transporte de nutrientes. 6) Uso fácil como fuente para obtener preparados de vacuolas y otros orgánulos celulares, ya que los tejidos vegetales contienen gran cantidad de celulosa, hemicelulosa, lignina, pectina... dificultan la homogeneización del material y alteran viabilidad de orgánulos.

Fusógenos químicos

1) Tratamiento con nitrato sódico. Se usó para la primera hibridación somática en plantas. Hoy día se usa poco por la baja frecuencia de heterocariontes, especialmente cuando se parte de protoplastos obtenidos de células del mesófilo altamente vacuoladas. 2) Medios que contienen Ca2+ a pH>9'5. Neutralizan la carga negativa de los protoplastos, favorecen su coalescencia y unión. 3) Polietilenglicol (PGE). Es el más usado, por su elevada estabilidad y facilidad de manipulación. Se usan soluciones a un 25-30% de peso molecular 1540, 4000 o 6000. La frecuencia de fusión de protoplastos suele ser de 10-40%. 4) Otros polímeros hidrosolubles: alcohol polivinílico, dextrano, gelatina y lecitina.

Definición de fusógeno

Agentes químicos o tratamientos físicos dirigidos a eliminar las cargas negativas de la superficie de protoplasto.

Fusión de protoplastos: hibridación somática

Antes de desarrollar nuevas paredes celulares, los protoplastos pueden fusionar sus membranas celulares desnudas y formas híbridos somáticos de forma espontánea o inducida. - Misma especie = homocarionte. - Distinta especie = heterocarionte. Generalmente son los únicos de interés para estudios de compatibilidad genética e hibridación.

Protoplastos vegetales: definición y obtención

Células vegetales de las que se han separado sus paredes celulares por un procedimiento mecánico o enzimático, dejando solamente el contenido celular rodeado por el plasmalema. Es una célula desnuda, capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse. No necesariamente se pueden regenerar plantas a partir de protoplastos (se ha conseguido en solanáceas y leguminosas). Se pueden obtener prácticamente de todos los órganos y tejidos vivos de la planta: hojas, pétalos, ápices de tallo...

Viabilidad de los protoplastos aislados

Proceso de plasmolisis y aislamiento de los protoplastos es estresante para las células debido a: 1) Pérdida de información posicional. 2) Ruptura de la comunicación intercelular vía plasmodesmos. 3) Alteración de la estructura del citoesqueleto. 4) Cambio en el suministro de nutrientes. 5) Alteración del volumen y área superficial. 6) Corrientes citoplasmáticas suelen cesar durante 24h después del aislamiento. Método para determinar la viabilidad de los protoplastos: evaluar bondad de técnica de aislamiento + conocer estado del cultivo, para usarlo para trabajos futuros. 1) Diacetato de fluoresceína. Si tiene actividad esterasa, separará el acetato quedando la fluoresceína libre, pudiendo ser detectada por microscopía de fluorescencia. - Ventaja: conteo de protoplastos viables por citometría de flujo (fluorescentes/totales(%)). 2) Rojo neutro. Se concentra sólo en protoplastos metabólicamente activos. 3) Colorantes como azul de Evans y fenolsafranina sólo tiñen protoplastos rotos o muertos. 4) Azul de metileno. Si tienen suficiente poder reductor, pasan de azul a amarillo. 5) Ciclosis o corrientes citoplasmáticas como medida de viabilidad.

Protoplastos vegetales: aislamiento y purificación

Se pueden usar plantas completas o material in vitro (callos o células en suspensión). Este último tiene la ventaja de no necesitar esterilizarse, pero puede ser genéticamente inestable y los protoplastos pueden presentar un elevado grado de heterogeneidad por variación somaclonal. Aislamiento: En medio isotónico, soluciones de azúcar, manitol, sorbitol o propilenglicol a 0'3-0'7 M. Tratamiento preplasmolizante: contracción de citoplasmas y cierre de plasmodesmos, se reduce cantidad de enzima incorporada y salida de contenido celular, permitiendo el aislamiento de protoplastos en mejores condiciones de viabilidad.

Protoplastos: métodos

Se tratan enzimáticamente las células con mezclas de enzimas fúngicas, en dos pasos (método secuencial) o en uno solo. 1) Método secuencial. Se trata primero el tejido con pectinasa, que degrada laminilla media y pectinas de la pared, quedando las células más o menos libres. Después, se tratan con una mezcla de celulasa y hemicelulasa que hidroliza las paredes y libera los protoplastos. Es un método más riguroso, quedan los protoplastos separados y uninucleados. 2) Método en un solo paso. Se usa una mezcla de enzimas que contiene pectinasas para separar las células y celulasas para digerir paredes. Da protoplastos multinucleados, se fusionan durante la preparación. Según naturaleza del material: enzimas a usar, concentración y tiempo de tratamiento.

Cultivo de protoplastos

Son más frágiles que las células, no se debe agitar el medio y hay que ajustar la osmolaridad. 1) Medio líquido. Normalmente en placas de Petri con elevada densidad de protoplastos para un pequeño volumen de medio nutritivo. Se reduce la pérdida de agua cerrándolas con parafilm, es importante que la capa sea poco profunda para mantener oxigenación y es especialmente apropiado para realizar hibridaciones. 2) Medio semisólido. Se mezcla una suspensión de protoplastos de densidad doble de la final requerida con un volumen igual de un medio de agar mantenido fundido a 43-45ºC. La concentración de agar debe dar un gel blando con suspensión de protoplastos y es apropiado para selección de tipos celulares (sólo tipos resistentes o con características bioquímicas crecen).

Protoplastos: purificación

Una vez obtenidos los protoplastos, es preciso purificarlos, normalmente por una combinación de filtración, centrifugación y lavado. 1) Filtrado. Tamices de acero inoxidable o nylon para retirar porciones de tejido no digerido, grumos celulares, agregados de pared celular, restos de células... 2) Centrifugado. 500g durante 5-10 min, se retira el sobrenadante con una pipeta Pasteur. 3) Resuspensión de protoplastos en solución de sacarosa 0'4M. 4) Lavado. Centrifugando a baja velocidad en un medio salino con cloruro cálcico al 0'2% y cloruro potásico al 2'5%, con pH 6.