Examen Final Regulació (Tema 1)
Patrones de reconocimiento en el DNA
Se unen al surco mayor porque hay mayor especificidad
Como se unen unas proteínas a la región del DNA?
- No hace falta abrir la hélice - Se unen a la hélice a través del exterior de la hélice
Conclusiones
- Una célula diferenciada contiene instrucciones genéticas para dirigir la formación de un organismo completo - La diferenciación se basa en cambios en la expresión génica y no en la pérdida irreversible de genes
Las células de un organismo pluricelular
- comparten el mismo genoma - difieren tanto en su estructura como en su función - cambios en la expresión celular del genoma - el genoma se conserva
Como se regula la expresión génica en células eucariotas?
...
Estudios Interacción DNA-Proteínas
...
Transferencia nuclear de célula somática en oocitos humanos
1. Cogen un oocito y le quitan los cromosomas y los centriolos 2. Meten un fibroblasto en el oocito 3. Se obtiene un embrioblasto 4. Así se tienen células madre pluripotentes personalizadas (pancreaticas, hematopoieticas, cardiomiocitos, hepatocitos, neuronas...) - Esto se usa para la regeneración/trasplante de tejidos sin peligro de rechazo (clonaje terapéutico) - rejeneración de tejidos, para evitar el rechazo del tejido - podrían curar enfermedades de origen DNA mitocondrial - prohibido en algunos países - se necesitan mujeres donantes - problemas éticos
Conservación del genoma durante la diferenciación celular - Plantas
1. Cogen una sección de la zanahoria 2. Ponen la sección para que prolifere 3. Separan las células en una medio líquido 4. Cogen una única célula 5. Las células se clonan 6. Se forma el embrión y luego la planta - en plantas es más fácil
Etapas del control de la expresión génica
1. Control transcripcional - determina que gen se expresa (el más importante) *transcripción del RNA* 2. Control del procesamiento del RNA - "splicing" *mRNA* 3. Control del transporte y localización del RNA *mRNA* 4. Control de degradación del mRNA - el RNA se puede degradar *mRNA inactivo* 4. Control de la traducción - que se va a traducir? *proteína* 5. Control actividad de la proteína - control de la actividad de la proteína (activación, inhibición o degradación) *proteína inactiva* - Las etapas 2 y 3 están ausentes en procariotas porque no tienen núcleo
La expresión génica se controla al menos en tres niveles
1. Código genético - promotores - regiones reguladoras 2. Código epigenético - conjunto de modificación de histonas y metilación de DNA 3. Programa de factores transcripcionales (sensores nucleares) - nivel de expresión y actividad de los factores de transcripción que expresa una célula - los tres niveles están interrelacionados
Conservación del genoma durante la diferenciación celular - Mamíferos
1. De una vaca cogen células epiteliales del oviducto 2. De otra vaca cogen un óvulo que no está fertilizado y quitan los cromosomas y los centriolos 3. Ponen la célula dentro de el óvulo 4. Un pulso eléctrico hace que se una la célula y el óvulo no fertilizado 5. Se forma el zigoto 6. La célula se divide y se forma el embrión 7. El embrión se mete en una madre 8. Nace una pequeña vaca - clonaron la oveja Dolly - Dolly nació a través de transferencia nuclear de célula somática - 277 intentos - NO SE HA HECHO CON OOCITOS HUMANOS
Distintos tipos celulares sintetizan distinto conjuntos de proteínas
1. Muchas proteínas son comunes a todas las células - codificados por los "genes housekeeping" 2. Algunas proteínas son abundantes en células especializadas - ex: proteínas de división celular (histonas, enzima RNA polimerasa, actina) 3. Los patrones de abundancia de RNAm (transcriptoma) son característicos de un tipo celular determinado - transcriptoma: conjunto de genes que se expresan en un tipo de célula, en un momento determinado (puede cambiar) - transcriptoma: específico al tejido o célula - nos pueden ayudar a saber de que tejido se trata el cáncer que estudiamos (nos permite tipificarla) 4. Grandes diferencias en el patrón de proteínas (proteoma) entre tipos celulares especializados: control post-transcripcional (maduración alternativa del pre-mRNA), modificaciones covalentes de las proteínas - proteoma: patrón de proteínas - mayor diferencia porque de un mismo mRNA pueden salir muchos mRNA por el proceso de maduración (splicing) - la electroforésis también nos permite comparar la cantidad * las fosforilaciones alteran mucho la carga, no el peso molecular
Proyecto ENCODE
5 años de trabajo de cientos de científicos de todo el mundo: - Análisis exhaustivo del genoma humano para identificar y catalogar los elementos funcionales del genoma (información más biológica del genoma). Cómo? - Mediante 24 tipos de experimentos analizaron 147 tipos distintos de células y en distintos momentos del desarrollo. Principal resultado - Un 80% del genoma participa en algún tipo de actividad o proceso regulador (gran controversia), en un tipo celular como mínimo, ya sea porque: - se esté transcribiendo - influya en la actividad de otros genes - se les esté uniendo algún tipo de proteína - afecte a cómo el DNA esté empaquetado - Finalmente el resultado se ha matizado: al menos el 20% del DNA tiene alguna función, en el sentido tradicional
Estructura de las proteínas reguladoras de genes
Contienen al menos dos dominios: 1. Un dominio de unión al DNA (que se une a secuencias reguladoras en el DNA) 2. Un dominio de activación que regula la transcripción al interactuar: - con el complejo de inicio de la transcripción directamente - a través de proteínas intermediarias (complejos coactivadores, complejos corepresores, complejos remodeladores...) 3. Un dominio que promueve la dimerización con otras proteínas reguladoras de genes para formar homodímeros o heterodímeros - pueden estar activadas constitutivamente o activarse por señales intra- o extracelulares - algunas pueden expresarse en todas las células y otras ser específicas de tejido - dimerización: la proteínas se puede unir al DNA como dímeros - homodímeros - reconocen la misma región reguladora - heterodímero - reconocen distinta región reguladora
Huella genética ("DNA footprinting")
Determinar la secuencia específica de DNA reconocida por una proteína reguladora, cuando ésta es conocida. 1. Se coge una región del DNA y luego hay un proceso de corte al azar mediante una nucleasa o un agente químico, seguido de la eliminación de la proteína y de la separación de las cadenas de DNA *mezcla de fragmentos de DNA radioactivos de distintos tamaños 2. Luego viene la separación por electroforésis en gel *patrón de bandas de DNA cortado en ausencia o presencia de una proteína Al compararse las secuencias se puede llegar a conocer la secuencia exacta de nucleótidos a la que se une la proteína
Factores de la transcripción
Dos clases funcionales: 1. Factores de la transcripción: se unen a la RNA pol II sobre el promotor (general transcription factors) 2. Factores de la transcripción específicos de secuencia/gen (proteínas reguladoras de genes): se unen a las regiones reguladoras y controlan la actividad de la RNA pol II (gene regulatory proteins) - activadores - represores
Ensayos de retraso en gel
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Búsqueda de factores de transcripción que se unen a una región de DNA conocida - Gel de poliacrilamida Estudios de interacción entre la proteína CAP y su región reguladora - Autorradiografía - cuando más grande la proteína más tarda en migrar hacia el lado positivo - con cAMP retrasa la migración en el gel
Dominios de unión al DNA de los factores de transcripción
Hay muchos dominios de unión al DNA - tienen una hélice alfa o una lámina beta
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP, chromatin immunoprecipitation)
Identificar lugares del DNA ocupados por proteínas reguladoras de genes o fragmentos de cromatina con modificaciones en células vivas 1. En una célula viva ciertas proteínas reguladoras se unen covalentemente a regiones del DNA 2. Estas uniones se fijan con formaldehido. Las células se lisan y el DNA se fragmenta de forma mecánica 3. El fragmento de cromatina unido a una determinada proteínas reguladora, factor de transcripción o que posee una determinada modificación se precipita utilizando anticuerpos específicos contra esas proteínas o histona modificada 4. Se revierte la unión DNA-proteína y la proteína se elimina 5. Cada fragmento de DNA inmunoprecipitado se amplifica y se secuencia de manera individual por qPCR El DNA representando posiciones en el genoma que estaban ocupados por proteínas reguladoras de genes en las células originales
ChIP-sequencing (chromatin immunoprecipitation and sequencing)
Inmunoprecipitación + secuenciación masiva de todo el DNA immunoprecipitado 1. Se aísla cromatina de células o tejidos y se fragmenta 2. Los fragmentos de DNA unidos a una determinada proteína asociada a la cromatina se precipitan utilizando anticuerpos específicos contra esa proteínas (un factor de transcripción, proteína reguladora, histonas modificadas, proteínas de unión a regiones de DNA metilado) 3. Se revierte la unión DNA-proteína y se recuperan los fragmentos de DNA 4. Los fragmentos de cromatina inmunoprecipitados se secuencian de manera masiva utilizando un secuenciador (Illumina) 5. Mediante análisis computacional se alinean con las de la base de datos del genoma de referencia 6. Se identifican zonas/locus específicos en el DNA de unión a proteínas
Cada tejido o tipo celular tiene un patrón de expresión génica característico
La mayoría de células especializadas pueden cambiar su expresión de proteínas en respuesta a señales extracelulares (ex: hormonas) o a condiciones patológicas (ex: infección o cáncer) Diferentes tipos celulares responden de forma diferente a una misma señal extracelular ex: glucagón acetilcolina: - disminuye en el corazón - aumenta en los músculos esqueléticos - puede haber diferentes receptores o no haber receptor para la señal - una cascada de señalización tiene que ocurrir y puede ser diferente
Dimerización de proteínas reguladoras de genes
Motivo de unión al DNA hélice-bucle-hélice Hélice alfa corta - dimerización Bucle - permite que una hélice se doble y quede alineada con la otra Hélice alfa larga - dominio de unión al DNA - Esta estructura es responsable tanto de la unión al DNA como de la dimerización --> forman homodímeros o heterodímeros La combinación de proteínas reguladoras para formar heterodímeros aumenta el repertorio de especificidades de unión a DNA --> Control combinatorio: combinaciones de proteínas controlan un proceso celular Las dos hélices alfa largas que sobresalen de la superfície de dimerización son las que se unen a regiones en el DNA: el homodímero reconoce secuencias simétricas de DNA
El punto de control más importante es el de la transcripción
Regiones reguladoras: - secuencias cortas de DNA definidas - factores de la transcripción -región de DNA - proteínas que se unen a la región Región control del gen X: * secuencias de DNA - promotor - indica el punto de inicio de la transcripción - varias regiones reguladoras - proteínas reguladoras de genes - activan o inhiben el DNA polimerasa
La heterodimerización también permite la regulación inhibidora
Regulación inhibidora de las proteínas HLH truncadas Proteínas HLH truncadas - heterodímero formado por una proteínas normal y una proteína que carece de la hélice alfa de unión al DNA - Heterodímeros HLH inactivos en exceso puede bloquear la homodimerización o heterodimerización de la proteína completa a impedir su unión al DNA
Regiones reguladoras o regiones reguladoras en cis o "response elements"
Son secuencias cortas de DNA definidas - cis: regulan genes que están en el mismo cromosoma - ex: MyoD (CAAATG) - desarrollo de músculo esquelético
Unión de una proteína reguladora al surco mayor del DNA
Son uniones fuertes y muy específicas Las proteínas establecen más de 20 uniones con el DNA incluyendo: - enlaces de hidrógeno - enlaces iónicos - interacciones hidrofóbicas Se hallan entre las interacciones más fuertes y específicas de las conocidas en biología La escructura tridimensional o geometría global que forma la región reguladora en el DNA es también importante en el reconocimiento entre la proteína reguladora y el DNA: proyecto ENCODE - proyecto ENCODE - buscaron regiones reguladores - se encuentran muchas más regiones de las que en verdad están unidas - para que dos moléculas se unan, tienen que encajar - las proteínas tienen un dominio de unión al DNA
Conservación del genoma durante la diferenciación celular - Ranas
Transferencia nuclear de célula somática 1. Cogen las células de la piel de una rata y cogen el núcleo con una pipeta 2. Un óvulo que no esta fertilizado, le destruyen el núcleo con rayos UV 3. Ponen el núcleo de las células de la piel en el óvulo 4. Se forma un embrión normal - una célula diferenciada tiene toda la información necesaria para poder dar vida a un organismo - Yamaka - hizo el método para obtener las células pluripotenciales inducida