Genoverdracht en de methodes daarvoor

Voordelen calciumfosfaat

- Benodigde componenten zijn gemakkelijk verkrijgbaar en goedkoop. - Techniek is gemakkelijk te beheersen. - Effectief voor veel soorten gekweekte cellen. - Geschikt voor transiënte- én stabiele transfectie (niet/wel inbouwen in het genoom).

Nadelen DEAE-dextran

- Cytotoxiciteit en lage transfectie-efficiëntie voor een reeks celtypen zijn (meestal minder dan 10% in primaire cellen). - Kan alleen gebruikt worden voor transiënte transfectie (niet inbouwen in het genoom) en is dus niet geschikt voor het genereren van stabiele cellijnen.

Heat-shock - Is de genoverdracht methode geschikt voor prokaryote cellen en/of eukaryote cellen? - Is de genoverdracht een transfectie (DNA in een eukaryote cel), transformatie (DNA in een prokaryote cel) of transductie methode (genoverdracht m.b.v. een virus)? - Is het een methode voor transiënte genoverdracht (inbrengen in de cel) en/of stabiele genoverdracht (inbrengen in het genoom)?

- Geschikt voor chemisch competente prokaryote cellen. - Transformatiemethode. - Transiënte genoverdracht. - Shock opent het al beschadigde celmembraan.

ELectroporatie - Is de genoverdracht methode geschikt voor prokaryote cellen en/of eukaryote cellen? - Is de genoverdracht een transfectie (DNA in een eukaryote cel), transformatie (DNA in een prokaryote cel) of transductie methode (genoverdracht m.b.v. een virus)? - Is het een methode voor transiënte genoverdracht (inbrengen in de cel) en/of stabiele genoverdracht (inbrengen in het genoom)?

- Geschikt voor electrocompetente pro-, en eukaryote cellen. - Transformatiemethode. - Transiënte genoverdracht. - Pulse opent de kanalen en trekt het negatief geladen DNA de cel in.

Liposomen - Is de genoverdracht methode geschikt voor prokaryote cellen en/of eukaryote cellen? - Is de genoverdracht een transfectie (DNA in een eukaryote cel), transformatie (DNA in een prokaryote cel) of transductie methode (genoverdracht m.b.v. een virus)? - Is het een methode voor transiënte genoverdracht (inbrengen in de cel) en/of stabiele genoverdracht (inbrengen in het genoom)?

- Geschikt voor genoverdracht in eukaryotische cellen. - Transfectiemethode. - Geschikt voor transiënte- én stabiele genoverdracht. - Endocytose of fusie met het plasmamembraan.

DEAE-dextran - Is de genoverdracht methode geschikt voor prokaryote cellen en/of eukaryote cellen? - Is de genoverdracht een transfectie (DNA in een eukaryote cel), transformatie (DNA in een prokaryote cel) of transductie methode (genoverdracht m.b.v. een virus)? - Is het een methode voor transiënte genoverdracht (inbrengen in de cel) en/of stabiele genoverdracht (inbrengen in het genoom)?

- Geschikt voor genoverdracht in eukaryotische cellen. - Transfectiemethode. - Transiënte genoverdracht. - Overdracht via endocytose of osmotische shock.

Calciumfosfaat - Is de genoverdracht methode geschikt voor prokaryote cellen en/of eukaryote cellen? - Is de genoverdracht een transfectie (DNA in een eukaryote cel), transformatie (DNA in een prokaryote cel) of transductie methode (genoverdracht m.b.v. een virus)? - Is het een methode voor transiënte genoverdracht (inbrengen in de cel) en/of stabiele genoverdracht (inbrengen in het genoom)?

- Geschikt voor genoverdracht in eukaryotische cellen. - Transfectiemethode. - Geschikt voor transiënte- én stabiele genoverdracht. - Het DNA komt de cel binnen door endocytose.

Transductie - Is de genoverdracht methode geschikt voor prokaryote cellen en/of eukaryote cellen? - Is de genoverdracht een transfectie (DNA in een eukaryote cel), transformatie (DNA in een prokaryote cel) of transductie methode (genoverdracht m.b.v. een virus)? - Is het een methode voor transiënte genoverdracht (inbrengen in de cel) en/of stabiele genoverdracht (inbrengen in het genoom)?

- Geschikt voor pro- en eukaryote cellen. - Genoverdracht met behulp van (bacteriofagen). - Stabiele genoverdracht. - Bacteriofaag neemt gewenst DNA op en injecteert DNA in aangeboden stam.

Nadelen calciumfosfaat

- Gevoelig voor kleine schommelingen in pH, temperatuur en bufferzoutconcentraties. - Kan cytotoxisch zijn voor vele celkweken, voornamelijk primaire cellen. - Ongeschikt voor in-vivo overdracht van DNA in (complete) dieren. - Relatief slechte transfectie-efficiëntie in vergelijking met ander chemische transfectie methodes zoals lipide-gemedieerde transfectie.

Voordelen liposomen

- Kan gebruikt worden voor transiënte- én stabiele transfectie (niet/wel inbouwen in het genoom). - Hoge transfectie-efficiëntie. - Werkzaam bij vele cellijnen.

Nadelen electroporatie

- Methode is erg gevoelig voor zoutconcentraties. Het DNA moet zuiver zijn voor electroporatie. - Methode is zeer gevoelig voor temperatuurschommelingen. Alle materialen voorafgaand aan de electroporatie moeten koud zijn. - Er zijn (dure) electroporatie cuvetten nodig en een electroporator. - Methode kan alleen gebruikt worden voor transiënte genoverdracht

Nadelen heat-shock

- Methode is zeer gevoelig voor temperatuurschommelingen. Alle materialen voorafgaand aan de transformatie (42 °C heat-shock) moeten koud zijn. - Bij zelfgemaakte chemisch competente cellen kan de transformatie-efficiëntie lager liggen. Methode kan alleen gebruikt worden voor transiënte genoverdracht

Nadelen transductie

- Niet alle fagen zijn geschikt voor transductie en niet alle cellen zijn gevoelig voor transductie. De faag heeft specifieke receptoren nodig om te kunnen binden aan een cel. - Ondanks dat transductie een stabiele methode is van genoverdracht, is aangetoond dat in veel gevallen het DNA niet in het genoom wordt opgenomen. - Limiet aan grootte van genoverdracht

Voordelen transductie

- Transductie is een stabiele methode van genoverdracht, waarbij het DNA in het genoom wordt ingebouwd en alle nakomelingen hetzelfde zijn. - Geschikt voor pro- en eukaryote cellen. - Vrij simpele en goedkope methode.

Nadelen liposomen

- Transfectie methode moet bij "nieuwe" cellijnen eerst geoptimaliseerd worden. - Vrij kostbare methode (lipiden moeten besteld worden).

Voordelen heat-shock

- Vrij simpele en goedkope manier voor transformatie. - Er kan een keuze worden gemaakt in welke bacteriesoort gebruikt wordt. Hierbij kan gelet worden op de natuurlijke eigenschappen (zoals bijvoorbeeld de aanwezigheid van T7 RNA polymerase) die aanwezig zijn in het genoom van de bacterie.

Voordelen electroporatie

- Vrij simpele en snelle methode. - Er kan een keuze worden gemaakt in welke bacteriesoort gebruikt wordt. Hierbij kan gelet worden op de natuurlijke eigenschappen (zoals bijvoorbeeld de aanwezigheid van T7 RNA polymerase) die aanwezig zijn in het genoom van de bacterie. - Geschikt voor pro- en eukaryote cellen.

Principe calciumfosfaat

Calciumfosfaat is een transfectie methode om genetisch materiaal in eukaryote cellen te brengen. DNA wordt gemengd met calciumchloride in een FZ/fosfaat oplossing. Hierdoor ontstaat een calcium-fosfaat-DNA co-precipitatie (neerslag). Dit wordt aan een celkweek toegevoegd. Calciumfosfaat vergemakkelijkt de binding van het gecondenseerde DNA in het co-precipitaat aan het celoppervlak en het DNA komt de cel binnen door endocytose. Vervlieging van de fosfaatbuffer tijdens het toevoegen van de DNA-calciumchloride-oplossing helpt ervoor te zorgen dat het gevormde neerslag zo fijn mogelijk is, wat belangrijk is omdat samengeklonterd DNA niet zo efficiënt aan de cel zal hechten of de cel zal binnendringen.

Principe DEAE-dextran

DEAE-Dextran is een transfectie methode om genetisch materiaal in eukaryote cellen te brengen. Diethylaminoethyl (DEAE) -dextran (is een polykationisch derivaat van het koolhydraatpolymeer dextran ???), het is één van de eerste chemische reagentia die gebruikt werd om DNA over te brengen naar gekweekte zoogdiercellen (Vaheri en Pagano, 1965). Het kationische DEAE-dextran-molecuul verbindt zich nauw met de negatief geladen backbone van het DNA. De netto positieve lading van het resulterende DNA-DEAE-dextran-complex zorgt ervoor dat het zich hecht aan het celmembraan en het cytoplasma binnendringt via endocytose of osmotische shock veroorzaakt door DMSO of glycerol.

Voordelen DEAE-dextran

De voordelen van DEAE-dextran-methode zijn: - Relatief eenvoudig. - Reproduceerbaarheid is goed. - Lage kosten.

Principe electroporatie

Electroporatie is een transformatie(/transfectie) methode om DNA in prokaryote- óf eukaryote cellen te brengen. De prokaryote cellen moeten hiervoor elektrocompetent zijn. Elektro-competente cellen kunnen gekocht worden maar je kunt ze ook zelf maken. Elektrocompetente cellen werken met behulp van het elektroporatieproces. Elektrische pulsen creëerden poriën waardoor genetisch materiaal het bacteriële membraan kan doordringen.

Principe heat-shock

Heat-shock is een transformatie methode om DNA in prokaryote cellen te brengen. De prokaryote cellen moeten hiervoor (chemisch) competent zijn. Chemisch competente cellen kunnen gekocht worden, maar ook gemakkelijk gemaakt worden op het lab. Chemisch competente cellen worden met calciumchloride behandeld om de hechting van het plasmide-DNA aan het competente celmembraan te vergemakkelijken. De competente cel wordt afwisselend verwarmd in een waterbad, dit opent de poriën van het celmembraan waardoor het plasmide kan binnendringen.

Principe liposomen

Liposomen kunnen gebruikt worden als transfectie methode. Een liposoom is een bolvormig blaasje met ten minste één lipide dubbellaag. Het liposoom kan worden gebruikt voor de toediening van voedingsstoffen en farmaceutische medicijnen, zoals lipide nanodeeltjes in mRNA-vaccins en DNA-vaccins. Liposomen kunnen worden bereid door biologische membranen te verstoren (door sonicatie). DNA is hydrofiel en kan niet door de hydrofobe celmembraan. Door het DNA te "verpakken" in een liposoom kan deze door het celmembraan door middel van endocytose of fusie met het plasmamembraan.

Principe transductie

Transductie is een genoverdracht methode waarbij gebruik gemaakt wordt van (bacterio)fagen. Het principe van transductie is gebaseerd op het infectiemechanisme van de bacteriofaag. Bij transductie wordt het bacteriële donor-DNA via de lytische of lysogene cyclus in de bacteriofaag opgenomen. Nadat het bacteriële DNA in de faag is opgenomen, komen er nieuwe fagen vrij uit de bacteriecel. Deze fagen infecteren vervolgens de bacteriële gastheercel. Fagen hechten zich aan een specifieke bacteriële celoppervlakreceptor en injecteren hun DNA dat het donor-DNA bevat in het cytoplasma van de bacteriële gastheercel. Afhankelijk van de faag integreert het DNA in het bacteriële genoom, repliceert het in het cytoplasma als een plasmide of repliceert het onmiddellijk en produceert het faag-nageslacht.