Splaisingas

Egzonas

seka, koduojama DNR molekulėje ir paliekama subrendusioje RNR.

Intronas

seka, koduojama DNR molekulėje, kopijuojama į pre-RNR molekulę ir splaisingo metu fiziškai iš jos atskiriama

Papildomi splaisinge dalyvaujantys baltymai.

splaisingo metu veikia ir į snurpsų sudėtį neįeinantys veiksniai: SR baltymai, N gale turi RRM domeną, kurio dėka sąveikauja su iRNR (substratu). Daugiausia dalyvauja reguliuojant splaisingą (alternatyviojo splaisingo valdyme esminiai). Atpažįsta egzone esančią ESE seką > dažniausiai veikia kaip splaisingo aktyvikliai. SR šeimos baltymai telkiami diskrečiose branduolio vietose. Kita splaisingo veiksnių grupė: hnRNP - heterologiniai branduolio ribonukleoproteinai. Tai baltymai > dar transkripcijos metu asocijuoja su iRNR ir iškart įtraukiami į ribonukleoproteininius kompleksus. Bet tai baltymai! Per RRM domeną, sąveikaujantį su RNR, veikimas panašus kaip SR baltymai, bet dažniausiai veikia slopinančiai jungdamiesi prie savo sekų (tiek egzonuose, tiek intronuose) neleidžiant prisijungti splaisingo komponentams. Funkcijos ne tik splaisinge, bet ir iRNR brendime, transkripcijoje.

A nukleotidas - lokalizacija ir reikšmė.

Šakojimosi taško sekoje yra konservatyvus adenino nukleotidas - introno užciklinimas trans-esterinimo pirmos reakcijos metu. Per A vyksta splaisingo mechanizmas, todėl konservatyvumas griežtai išlaikomas.

Cis veiksniai, dalyvaujantys branduolio splaisinge.

Cis veiksniai dalyvaujantys branduolio splaisinge: nukleotidų sekos iRNR sintezei, į prie-iRNR nurašomos visos reikalingos molekulės splaisingui cis sekos: penki ' splaisingo sritis, trys ' splaisingo sritis, šakojimosi taško seka - vieta kurią viename iš etapų atpažįsta splaisosoma, ji yra introne (arčiau introno trys ' splaisingo srities), polipirimidinų ruožas (ne visuose, vienaląsčiai neturi) - seka, kurioje gausu pirimidinų, ji lokalizuota tarp šakojimosi sekos ir trys ' splaisingo srities. Tai minimalus cis elementų rinkinys, užtikrinantis bazinį splaisingą. Papildomai - splaisingo stiprikliai ir slopikliai - trumpi sekų elementai, esantys tiek intronuose, tiek egzonuose, atpažįstami trans veiksnių - alternatyvaus splaisingo reguliacijai

Splaisingas

Intronų iškirpimas ir egzonų sujungimas, vykstantis RNR brendimo metu.

Splaisosomos veikimas.

Ji atpažįsta introną, aktyvina chemines reakcijas - transesterinimo reakcijas - analogiškai II tipo savaiminiam išsikirpimui, tik reakcijas vykdo splaisosomos kompleksas, ne pati iRNR. Pirmos reakcijos metu introne šakojimosi taško sekos A splaisosomos dėka generuojamas nukleofilas, tam reikalingas vienas iš dviejų Mg jonų, kurį suteikia taip pat splaisosoma. Vyksta ataka penki ' gale, susidaro naujas esterinis ryšys, intronas užciklinamas. Hidrolizuotas egzonas laikomas splaisosomoje dėl sąveikos. Iš pirmo egzono deguonies generuojamas nukleofilas atakuoja kitą sritį. Viskas analogiška, bet pozicionavimą, kofaktorius, nukleofilų generaciją atlieka splaisosoma.

Prp8 baltymas.

Prp8 baltymas. Sudarytas iš septynių domenų. Suriša splaisosomos katalizinio centro RNR molekulių dalis, paviršius tos vietos įkrautas teigiamai.

Trans veiksniai

Splaisosoma - ribonukleoproteinas, sudarytas iš kelių RNR molekulių ir daug baltymų molekulių, labai didelis kompleksas. Be splaisosomos yra papildomi baltymai, galintys atpažinti ir jungtis prie cis sekų, kt. domenais sąveikauti su kitais splaisingo komponentais. Dvi pagrindinės grupės: SR šeimos baltymai, ir heterologiniai branduolio baltymai (hnRNP, RNP - ribonukleoproteinas). Splaisosoma užtikrina tik bazinį splaisingą, moduliacijai reikalingi splaisingo veiksniai, papildomos sąveikos.

Splaisosomos sandara.

Splaisosomos pagrindą sudaro penkios ribonukleoproteinų dalelės snRNP. Kiekviena jų turi RNR molekulę(es) ir baltymines dalis. Du baltyminiai kompleksai funkcionuojantys splaisingo metu (reakcijoms) ir substrato atpažinimui : NTC ir į NTC panašus kompleksas. Virš dešimt splaisingo veiksnių - atpažinimui, sąveikai su RNR ir kt. komponentais. Nuo RNR priklausomos ATPazės, pasižyminčios helikaziniu aktyvumu, funkcija- dalyvauti RNR-RNR sąveikų pertvarkyme. Papildomi reguliaciniai ir pagalbiniai baltymai priklausomai nuo organizmo. Ją sudaro kelios atskiros snRNP - maži branduolio (branduolėlio?) ribonukleoproteinai. Jų yra penki: U1, U2, U4 ir U6 susijungia kartu ir sudaro U4/U6 (susidaro dėl komplementarumo tarp U snRNR), ir U5. Iš viso penkios, bet dvi susijungia į vieną kompleksą. snRNP - snurpsai. U raidės žymėjimas, nes jos turi U turtingas RNR. (šiaip U yra dvylika žinomų, bet penkios sutinkamos snurpsuose). Visos penkios dalelės būna tik tam tikru splaisingo metu, branduolyje telkiamos kaip atskiros struktūros ir tik splaisingo metu ties substratu jos tam tikra tvarka montuojasi į splaisosomą. Susijungusios egzistuoja gana trumpą laiką. snRNP daleles sudaro savita U snRNR molekulė (u1, u2, u4, u5, u6). Individualios sekos ir erdvinės struktūros kiekvienam snurpsui. Be individualios U molekulės kiekvienoj dalelėj yra konservatyvių Sm baltymų rinkinys. Iš viso šių baltymų yra septyni, jie suformuoja savitą žiedo pavidalo struktūros kompleksą, U dalelės išskyrus U6 turi tokį patį rinkinį Sm baltymų. Jie svarbūs dalelių susirinkimui į baigtinius ribonukleoproteininius kompleksus ir dalelių funkcijoms. U6 dalelės biogenezė kitokia nei kitų keturių snurpsų, todėl jos baltymų komplekso kitokia sudėtis. Kiekvienas snurpsas taip pat turi būdingus rinkinius savitų baltymų. U1 snRNP slaisinge dalyvauja/ prisijungia pirmoji. Sm baltymai svarbūs dalelių biogenezei ir funkcijoms. Kiekvienas žiedo baltymas turi sąveikos su kitu baltymų domeną ir susiformuoja septynių baltymų žiedas. Atpažįsta U1 snRNR molekulėje žiedo prisijungimo sritį. U dalelių (snurpsų) išskyrus U6 biogenezė gana sudėtinga, pereina branduolio ir citozolio etapus. Suformuojama kepurė, išnešama į citozolį, montuojasi Sm baltymai (tai užtikrina Smn kompleksas, mutacijos šiame komplekse susijusios su raumenų atrofija). Prijungus Sm žiedą, grąžinamos į branduolį ir laikomos telkimo vietose - Kajalo kūneliuose. Tokie snurpsai jau gali dalyvauti splaisinge. U snRNR molekulės savita struktūra svarbi sąveikai su pre-iRNR (substratu).

Splaisosomos susimontavimas.

U RNR pasižymi komplementariom sąveikom tiek tarpusavy, tiek su substratu RNR. Daug susimontavimo etapų. Splaisosomos montavimasis dinamiškas, vyksta pokyčiai struktūroje. Dviejų etapų transesterinimo katalizė vyksta tik susidarius tam tikram kompleksui. Kur yra ATPazės, vyksta struktūriniai pokyčiai, ATPazių dalyvauja nemažai - aštuonios. Pirma, preiRNR truinti introną, yra atpažįstama jos penki ' splaisingo sritis, atpažįsta U1 snRNP, susidaro nestipri sąveiką tarp šių dalių, nes U1 turi nedidelę šiai konservatyviai sekai komplementarią sritį. Tai vadinama E kompleksu. Introno penki ' gale prasideda ir BP nustatymas, nustato dimerinis baltymas U2AF. Jungiasi prie polipirimidininės srities, o SF1 jungiasi prie šakojimosi taško srities. Toliau - E komplekso perėjimas į kitą struktūrą - A kompleksą. Prie iRNR turi prisijungti kita dalelė U2 snRNP. Ji jungiasi taip, kad būtų lokalizuotas BP srities A nukleotidas, kuris tarnaus kaip nukleofilas transesterinimo pirmoje reakcijoje. Konservatyvia sritimi U snRNP sudaro komplementarią sąveiką su iRNR BP sritimi - vyksta konservatyvaus A nukleotido išstūmimas iš duplekso ir taip pasiruošiama nukleotido pozicionavimui splaisosomoje. Sąveika RNR-RNR - pagrindinė ir esminė, bet dalyvauja ir baltymai. BP taško srities mutacijos blokuoja splaisingą. Toliau į splaisosomą jungiasi likusios trys dalelės U5, U4/U6, susiformuoja pre-B kompleksas. Tai laikinas kompleksas. U5 dalelė turi stiebo kilpos struktūrą, kilpa turtinga U nukleotidais ir per juos sąveikų dėka ji sudaro komplementarius ryšius su abijeų egzonų kraštuose esančiais nt ir fiksuoja egzonus. U4/U6 viena RNR molekulės dalis sąveikauja su U2. Tam, kad A būtų pozicionuotas ties pirmo egzono penki ' splaisingo sritimi, turi įvykti persitvarkymai splaisosomoje. Į šias pertvarkas įsijungia nuo RNR priklausomos ATPazės: iš komplekso disocijuoja U1 ir U4 dalelės. Disocijavus U4, perorganizuojama U6 struktūra ir ji gali dalyvauti katalizėje (viena esminių slaisingui, koordinuoja magnio jonus). Kompleksas virsta aktyvintu kompleksu Bact. Splaisosoma paruošta katalizinėms reakcijoms - B* kompleksas. Pirma reakcija - C kompleksas. Antra reakcija - C* kompleksas. Pašalinus introną ir sujungus egzonus - P kompleksas.

U6 molekulės konservatyvi dalis.

U6 molekulės konservatyvi dalis - ISL kilpa, pozicionuoja metalo jonus kataliziniame centre taip, kad iš pradžių būtų aktyvintas BP išstumtas A nukleotidas, jo du ' hidroksi grupės deguonis tampa nukleofilu. Metalo jonas du atlieka tą funkciją. Antroje rekacijoe šitą funkciją perima M vienas metalo jonas. (pasikeičia darbais tarp reakcijų). ISL struktūra panaši į savaime išsikerpančių II grupės intronų V domeną (atlieka metalo jonų koordinavimą), todėl splaisingo mechanizmas kildinamas iš šios grupės intronų splaisingo mechanizmo.

Splaisingo komponentų lokalizacija.

branduolio dėmėse ir didesnėse struktūrose - Kajalo kūneliuose