Eksamens øving, lang

Hvilke fordeler er det med å bruke zebrafisk på lab?

(1) De er lette å manipulere genetisk. Deler mye av genomet sitt med oss mennesker (2) Embryoer og larver gjennomsiktige (3) De utløser ikke allergier og krever liten plass (4) Vokser raskt og kan legge hundrevis av egg hver uke

Kva stoff blei brukt i den blanke eppendorfen tuben i Bradford metoden/coomassie?

0.15 M NaCl (200 µ)

Kva skjer i dei ulike steg ai ein PCR-reaksjon?

1. Denaturering. (høgst temperatur). Temperaturen blir kjørt opp slik at DNA tråden blir denaturert og splittar seg 2. Annealing. (lågast temperatur)Dei to dna trådane blir nedkjølt, og primer trådane festar seg. 3. DNA syntese.(midt i mellom temp) Polymerasen bruker nukleotida til å amplify-e dna tråden.

Kva er forskjellen mellom stacking gelen og seperasjons gelen?

1. Stacking gelen har større porer (4% acrylamid) Da flytter alle proteina seg i samme fart i denne delen .........

Hvor lang tid tar det å gå fra celle til zebrafisk?

17 timer, eller 2 daga? (:0)

Kva stoff var det i mastermixen?

1x = H2O (12.1µl) 10x Rxn buffer (2.0 µl) 25mM MgCl2 (1.8 µl) 10mM dNTP (0.4 µl) 10µM Fwdp P45 (1.0 µl) 10µM RevP P47 (1.0 µl) Polymerase (0.3µl)

Kor mange cuvetter blir brutk i forsøket er en skal måle enzym-aktiviteten? Ikkje lage standarskurva

2 stykk, en blank uten enzym og en med enzym.

Kva stoff var i gelen til gelelectrophores-a?

2% agarose, 1XTAE (50 ml gel) og ethidium bromid (0,5 mikro gram/ ml) i 50 ml stocksolution? Kva andre stoff var i lag med ethidium bromiden, og kva er en stock solution?

Kva bølgelengde range skulle vi stille inn UV-maskina på?

250-320 nm

kva blei den maksimale absorbansen på, på UV-forsøket?

280 nm

Kva blir bølgelengda satt til på målinga av enzym for å lage standard kurva?

420 nm

Kva vart bølgelengda satt til på Biuret forsøket?

550 nm

Kor mange ulike sample hadde vi i UV-spektrometri forsøket? (med blank og ukjente)

6 stykk, en blansk, 2 ukjente

Hvor mye av vårt genom deler vi med zebrafisken?

70%

Kva betyr mastermix? kva betydning har det?

????

(Beer's law) Absorbansen er proposjonal med ...?

Absorbansen er proposjonal med konsentrasjonen

Kor mykje coomassie vart lagt til kvar eppendorfen tube i Coomassie forsøket? og kven av dei 6 Prøvene fekk d i seg

Alle eppendorfen tubene fikk 1 ml Coobassie i seg, blank og. Og vart derreter vortex-a

Kva kan bli brukt som buffer?

Alle svake syrer eller baser og deres korresponderende salter kan bli brukt som buffere.

Kva gjer DTT og SDS med proteinet?

B-mercaptoethanol or DTT reduce existing disulphide bonds, while SDS binds to and denatures proteins. On average, one molecule of SDS binds two amino acids.

why use of BSA as a standard protein? Hvorfor er BSA det mest nytta standardproteinet?

BSA blir brukt på grunn av sin stabilitet for å øke signal i analyser, sin mangel på effekt i mange biokjemiske reaksjoner, og dens lave pris.

Hva er BSA?

BSA standard kurve, en kurve lagd av fleire kjente utynna stoff (samme stoff), brukt til å finne konsentrasjonen til den ukjente løysinga

Kva heiter enzymet som blei brukt i PCR-forsøket?

BsrBI-

Forklart prinsippet bak UV-metoden

Bølgelengder på 280 nm blir sendt mot løsningen, hvor aromatiske aminosyrer tryptophan, tyrosin og phenylalanine aborberer strålingen. DA trenger man ikke addere fargestoffer, fordi nesten alle proteiner består av disse aminosyrene.

Kva metode er blitt brukt for å lage park7 knock-out fiskane?

CRISPR Cas-9 metoden har targeta det første eksonet i park 7 genet, og forstyrra et BsrBIi restriskjonsenzym sete.

Hva annet navn kan brukes til Bradford metoden?

Coomassie

Kva ulike delar må ein ha med i ein pcr-reaksjon?

DNA, buffer, Primer, varmeresistent primer(Taq), nukleotid

Kva er det latinske navnet til zebra fisk?

Danio rerio

Kva gjer ethidium bromid i gelen?

Den binder DNA og fluoressensen sammen. Ethidium bromid er kreftfremkallande fordi det fester seg til DNA, og fungerer difor godt til å feste seg til DNA som skal analyserast.

Kva blir gjort med gelen fra westernblottinga?

Den blir staina med coomassie brilliand blue for å se om det er noe protein igjen i geleen. Om det er protein igjen i geleen kan det bety at electrophoresen ble kjørt for kort tid.

Kor gammel er fisken når den blir finnclipped?

Den er 2 mnd gammel

Hvilke ulemper har UV-metoden

Den er ikke sensitiv, andre aromatiske komponenter kan påvirke og den trenger rent protein som er sjeldent. nukleinsyrer har max absorbans på 260 nm, og blir også absortbert på 280 nm.

På labben under PCR-forsøket. Kva type var den kjente fin-clip solutionen?

Den kjente var en Wildtype, men berre den eine blei tilsatt enzym i

Kva er formålet med stacking gelen?

Den skal auke protein konsentrasjonen til sterke tydelige bånd

Kva vart bølgelenda satt til på Coomassie/Bradford forsøket? og kvifor?

Den vart satt til 595 nm, for når Coomassie blue G-250 binder seg til protein endrer den absorbasjons maxen fra 465 til 595.

kva er dNTP i mastermixen?

Deoxynucleoside triphosphates, det er 4 basiske nukleotid som blir brukt som byggekloss for dei nye DNA-trådane wow ja d e (Thymin, Adenen, Cytosin, Guanin)

Hvorfor kan to ulike proteinløsninger, som inneholder samme mengde protein, gje ulike resultater når man nytter bradfordmetoden?

Dersom ene proteinløsningen har mer eller mindre basiske aminosyrer vil dette påvirke dens absorbanskapasitet.

Kva går biuret metoden ut på?

Det at to eller flere peptidbindinger vil i alkaline og kopppersalt forme en rød farge. Metoden differensierer ikke mellom proteiner, som er bra <3 Metoden er bittelitt denaturerende. Biuret former et farget kompleks med Cu2+ ioner.

Kva blir biuret + Cu^2+ ?

Det blir daqnna eit fargekompleks, med alle compounds med to eller fleire CONH_2 grupper. Dei er enten direkte bunde samen eller bundesamen med eit karbon eller nitrogen atom

Koffor er det MgCl2 i mastermixen?

Det er en kofaktor for å optimalisere enzymaktiviteten til DNA-polymerasen. Den booster DNA-amplifiseringa (Steg3)

Korleis vart dei ukjente konsentrasjonane funnet i UV-forsøket?

Det vart satt opp ei standarskurve med dei kjente konsentrasjonane og absorbansen. Så blei formelen --> brukt. Skrevet i rapporten A = a*c +b kva står dei ulike bokstavane for?

Om det er inhhibitoar i DNA-blandinga, kva kan ein gjere for å ha like høg PCR "yield" (mengden dna pr. mg)

Ein kan auke mengden DNA-polymerase.

What is the basis of photometry?

Electromagnetic radiation will change when passed through a solution. The change results from absorption at one or more frequencies of the incoming radiation by the solvent and the molecules dissolved in. The difference between in-and outgoing radiation is detected with radiation sensitive photometric detectors, and is the basis for the analysis.

Hva er elektroforese, enkelt forklart?

Elektroforesen separerer molekylene i et elektrisk felt med hensyn på masse og ladning.

kva er ein mastermix?

En mix av uklike PCR-reagenser med optimal konsentrasjon. Den inneheld ofte: DNA-polymerase, buffer, dNTPs og MgCl2. For å spare tid og mixe- feilkjelde

Kva to hovud delar består SDS-gelen av?

En stacking gel og en sepesasjonsgel

Kva bioinformatiske verktøy bruker vi for å finne ut kor langt det forventa PCR-produktet skal bli?

Ensembl.org og Nebcutter

Etter PCR-reaksjonen blir kjørt, kva blir tilsatt dei ulike prøvene.

Enzymet BsrBI, om det var umutert DNA i prøva, vil BsrBi kutte DNA-et

Kor kjem den fluoriserande fargen fra?

Ethidium bromid

Koffor skal man ha en blank prøve i UV-spektrometri forsøket?

For å sette null-grunnlinjen

Koffor må vi screene fisken for å vite om den er wildtype, homozygote elelr hetrozygote?

For å unngå "off-target" effekt, blir den homozygote linjen kryssa med wildtype. Fiskane blir voksne og så kryssa.

hva skjer hvis man ikke bruker en stacking gel?

Gel-veggen er ca. 1cm dyp, og vanligvis trenger man å fylle på ganske greit for å få nok protein på gelen. Så hvis det ikke er noe gel, vil prøven din bare ligge oppå running gelen som et bånd opp til 1cm dypt. I stedet for å treffe running gelen samtidig, vil det si at proteinene i prøven vil treffe running gelen til forskjellig tidspunkt og det vil resultere i veldig utydelige bånd

kvifor blir glycerol brukt i SDS-PAGE-en?

Glycerol har høgre density (tettheit) enn electrophprese buffen, og gjer slik at prøvene kan settle på bunnen av well-sa

Hva er egentlig poenget med de forskjellige pH-verdiene?

Glysin kan eksistere i tre forskjellige ladnings-tilstander; positiv, nøytral eller negativ, avhengig av pH-verdien. Dette er vist i figuren under. Kontroll av ladningstilstanden til glysin ved de forskjellige bufferne er nøkkelen til hele stacking gelen.

Kva er formelen til Biuret?

H2N-CO-NH-CO-NH2. lik den generelle protein formelen.

Kva var i den blanke eppendorfen tuben i Biuret forsøket?

H2O (200 µl) + 1 ml Biuret reagens

Kva fisk blir holdt til vidare avling?

Homozygote

why do the two proteins not give the same result in each method?

I teorien skulle begge proteinene ha gitt samme resultat i hver metode, men det skjedde ikke. Grunnen til det er fordi hver metode oppdager forskjellige egenskaper ved proteinene og de to proteinene har ulik aminosyresammensetning. UV-absorpsjon oppdager hovedsakelig aromatiske aminosyrer som tyrosin og tryptofan. Biuret metoden oppdager peptidbindinger, og Bradford metoden oppdager hovedsakelig de basiske aminosyrene arginin og lysin.

Hva har ulike acrylamid kosentrasjon å si i gelen i SDS-Page?

Jo høyere konsentrasjon akrylamid, jo minre porer dv. jo mindre proteiner klarer å buvege seg.

Kva er gangen i westenblotting?

Kjør electroforese av brain lysate. med sample buffer. stop når den blå stipa er på bunnen. Nå skal proteina bli transferred til en nitrocellulose membrane med electrophoresis, med en Mini Trans-Blot Cell. "blotting sandwitchen" i electrophorese fører proteinen over fra gelen til membranen med antigen. Neste dag blir membranen dekt med poceaus S, for staining. Skyll membranen med vann. Blokk membranen med tørrmelk i TBS. Ha membranen i en pose med muse anti DJ-1. Rinse. Ha i 10 ml av 2. antigen( goat anti Mouse IgG festatil HRP). (lese meir siste del)

Kva er prinsippet bak gel-eletroforese

Negativt lada DNA migrer fra negativt lada delen mot den positivt lada. Det mindre fragment det lengre og raskare reiser dei gjennom porene i gelen. Ein lyser deretter på gelen med UV-lys for å sjå kvar i stigen dei ulike DNA-fragmenta har samla seg.

Kva ulike stoff er i eppendorf tubene i enzym delen av spektrometri forsøket?

ONPG( enzyme susbtrat), Buffer, H2O og enzymet. Bland har ikkje ONPG

Kva farge gir Biuret + Cu^2+ + protein eller peptid?

Protein gir mørk blå-rød aktig farge (Mørke lilla?) peptid gir rosa rage

Hva står SDS-Pagefor?

Sodium Dodecyl Sulphate

Kva står SDS-PAGE for?

Sodium Dodecyl Sulphate- PolyacrylAmide Gel Electrophoresis

hva er ph stacking gel vs running gel?

Stacking gel 6.8 pH, running gel 8.8 pH

Kor kommer navnet biuret fra?

The name Biuret comes from the compound biuret, formed by heating of urea.

Kva er formålet med SDS-page og westernblotting forsøket?

These methods will be used to separate proteins obtained from the protein extracts obtained from zebrafish brains belonging to wild type, DJ-1 knockout (dj-1- /-), and DJ-1 knockout ( + /-) fish

Kort fortalt hvordan kan de 3 ulike metodene brukt til å determinere protein i Spektrophotometri øvelsen karekteriserest?

UV: Does not interact with the proteins. Detects aromatic amino acids (tyrosine and tryptophan). Coomassie: Strongly denaturing. Mainly detects basic amino acids (lysine and arginine) Biuret: Non-denaturing. Detects peptide bonds. In theory, does not separate between proteins.

Korleis kunne vi få tak i gel-electrophorese resultata?

Vi måtte passe på at ikkje gelen blei kjørt for lenge med elektrisitet, og deretter blei den putta i en gel-documentation system (BIO-RAD Gel Doc EZ IMAGER). Her er den eksponert for UV-lys

Kva slags reaksjon skjer i Coomassie forsøket? kva reagerer og kva bindinger blir danna?

aminosyrane Argenin og Lysin i proteinet reagerar med kvarandre og dannar hydrofobe og isoniske bindingar

Kor lenge skulle Biuret blandinga står etter den var mixa med Vortex, og koffor?

den skulle stå 30 min. fordi???

hva heiter stoffet som gelen var "submerged" i?

det var 300 ml 1x TAE buffer.

Kva er westernblotting, kort fortalt?

en electrphoretic metode for å detektere og identisfisere spesielle protein ved hjelp av antistoff.

kva blir samplane som skal bli separert med av SDS-PAGEN kokt i?

en sample buffer av reduksjonsmiddelet b-mercaptoethanol eller dithiothreitol (DTT) (bilde)

Kva stoff blei brukt for å hente ut det genomiske DNA-et?

fenol, kloroform DNA purification, dryppa med ethanol, lagra på -20 C

Kva tidsrammer/intervaller vart brukt for å måle enzym aktiviteten?

hvert 5 sek i 3 minutter

Kva protein konsentrasjon passer Coomassie (Bradford) forsøket til?

lav protein konsentrasjon (1-100µg/ml)

Skal enzym blandinga Vortex-ast? koffor?

nej. fordi....?

Kva består nitrocellulose membranen av, kva er på den?

nitrocellulose membranen er incubert med antibodies. Da blir antigenet detektert med DJ-1 antibodies produsert av harer, deretter antibody fra geiter. Antibody 1 og 2 vil bli detcted med chemiluminescence (ELC)

Kva type cuvette skulle ein bruke til UV-spektrometrien? og kvifor?

quartz cuvette, for løysinga var fargelaus.

Kva anna inneholder sample buffern enn b-mercaptoethanol eller DTT?

the sample buffer contains an ionisable colour, usually bromophenol blue, as well as a 0,5 M Tris-HCl buffer with pH 6,8 and glycerol.

Kva er TBS?

tris buffered saline. (Les meir)

Hva er formelen for å rekne ut farten til de ladede molekylene?

v= E×q / f (Bruka vi den noken gong til å rekne ut noke?)

Kva enhet blir brukt til spesefik enzym aktivitet?

µmol/ (min * mg)

Kva enhet blir enzym aktiviteten målt i?

µmol/ min

I kva forsøk og kva er det reknestykker ein må gjere?

Øvlelse 1: Rekne konsentrasjon til ukjente løysingar. Beers law. og milligram til mikrogram og omvendt. bruka initial velocity V0 formel, for enzym aktivitet Øvelse 2: lage 2% agarosegel og 0.5 mikrogram/ml ethidium bromid, utynningsformel. Øvelse 3: rekne ut konsentrasjon og prosent i gel. meir?

Kva enzym blir brukt i dermineringa av enzymaktivitet i spektrophotometri øvelsen?

β-Galactosidase