Elektroforéza + štiepenie DNA

Čo je DNA metyláza?

- Enzým korešpondujúci k príslušnej RE - katalyzuje prenos metylovej skupiny z S-adenolzylmetionínu na 5-metylcytidín, N4- metylcytidín alebo N6-metyladenín - majú rovnakú rozoznávaciu sekvenciu ako príslušná restrikáza, a tým zabezpečujú ochranu bunkovej DNA pred štiepením - napr. metyláza M.EcoRI prenáša metylovú skupinu na adenozín nachádzajúci sa v polohe 3 v rozoznávacej sekvencii GAAm6TTC

DNázaI

- edodeoxyribonukleáza izolovaná z hovädzieho pankreasu - štiepi jednovláknovú aj dvojvláknovú DNA za pyrimidínovými nukleotidmi - odstránenie prímesí DNA pri izolácii RNA

RNázaA

- endoribonukleóza, tiež hovädzí pankreas - štiepi RNA za 3 koncom pyrimidínových nukleotidov - veľmi stabilný - nevyžaduje dvojmocné ióny

DNA polymeráza

- enzým, ktorý katalyzuje syntézu druhého vlákna DNA v smere 5'-3' využitím molekúl dNTP - pre svoju aktivitu potrebuje templát a primer - má najväčšie využitie pri metóde PCR a pri sekvenovaní DNA

Charakterizuj horizontálnu elektroforetickú aparatúru?

- gél ponorený v elektroforetickom tlmivom roztoku (TAE, TBE) - pri príprave gélu sa agaróza rozvarí v elektroforetickom roztoku, vyleje do formy s vloženým hrebeňom pre vytvorenie dráh, nechá stuhnúť pri lab teplote - po vychladnutí sa hrebeň vytiahne a gél vloží do elektroforetickej aparatúry s roztokom TAE - pred nanesením na gél sa vzorky zmiešajú s nanášacou farbičkou pre elektroforézu (STOP C/SBX): . zabezpečuje zvýšenie hustoty roztoku, aby pri nanášaní klesol na dno . nanášací roztok obsahuje farbivá (brómfenolová modrá, xylén cyanol), ktoré sa pri elektroforéze pohybujú podobne ako DNA a umožňujú sledovať jej priebeh . niektoré roztoky tiež obsahujú látky (EDTA, SDS), ktoré inaktivujú enzýmy (napr. restrikčné endonukleázy) pred elektroforézou

Na akom princípe a na čo slúži elektroforéza?

- metóda na rozdelenie makromolekúl - v roztoku sa nabité molekuly v elektrickom poli pohybujú k jednej z elektród - DNA je kyselina, obsahuje záporne nabité fosfátové skupiny - fragmenty DNA sa pohybujú od zápornej elektródy ku kladnej

T4 DNA ligáza

- na aktivitu potrebuje prítonosť Mg2+ iónov + ATP - izolovaný z E.Coli infikovaných bakteriofágom T4 - teplota ligácie: 8-16C: zabezpečenie stability anelácie krátkych komplementárnych kohéznych koncov

Čo sú IZOSCHIZOMÉRY?

- restrikčné endonukleázy izolované z rôznych mikroorganizmov,kt. majú rovnakú rozoznávaciu sekvenciu, a teda štiepia DNA na rovnakých miestach - enzýmy SacI, SstI a EcoICRI - môžu sa navzájom líšiť v mieste štiepenia: . napr. oba enzýmy SacI a SstI štiepia v rovnakej polohe a zanechávajú 3´konce . enzým EcoICRI štiepi v strede sekvencie a zanecháva tupé konce NEOIZOSCHIZOMÉR - rozdielne podmienky aktivity (teplota, reakčná zmes) - rozdielna citlivosť k metylácii DNA - môže sa využiť pri sledovaní stupňa metylácie DNA, napríklad porovnaním štiepnych profilov MspI (necitlivý k metylácii) a HpaII (citlivý k metylácii)

Aké sú RE 1. triedy?

- rozpoznávajú ŠPECIFICKÚ sekvenciu, ale štiepia DNA v NEŠPECIFICKÝCH miestach (zvyčajne 100 - 1000 bp za rozoznávacou sekvenciou) - restrikčná endonukleáza a DNA metyláza sú lokalizované na rozdielnych podjednotkách multifunkčného enzýmového komplexu - pre štiepenie sú kofaktory Mg2+, ATP a S-adenozylmetionín

RE 3. triedy?

- skladajú sa z dvoch podjednotiek: - prvá má rozoznávaciu a metylačnú funkciu - druhá restrikčnú .... obe fungujú dohromady - restrikčná endnukleáza štiepi vo vzdialenosti 24-26 bp od rozoznávacej sekvencie - kofaktormi sú Mg2+ a ATP (a v niektorých prípadoch aj S-adenozylmetionín)

RNA polymeráza

- syntetizuje molekuly RNA podľa templátu DNA s využitím NTP - ako počiatok potrebuje promótor - pri in vitro transkripcii sa používajú RNA polymerázy izolované z bakteriofágov SP6, T3, T7 - schopná syntetizovať veľké množstvá RNA

RE 2. triedy?

- štiepia DNA priamo v rozoznávacej sekvencii - restriktáza a metyláza sú dva samostatné proteíny - pri štiepení vyžaduje ako kofaktor len Mg2+ ióny - táto skupina enzýmov sa používa v technikách rekombinantnej DNA

RE 4. triedy?

- štiepia metylovanú DNA

Množstvo enzýmu v enzýmových jednotkách? Ako je definovaná jedna jednotka RE?

1 U (jedna jednotka) restrikčnej endonukleázy je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré úplne poštiepi 1 μg DNA pri teplote 37°C (optimálnej teplote) za 1 hodinu v 50 μl optimálnej reakčnej zmesi

Aký je prac. postup pri štiepení DNA RE?

1. koncentrovaná reakčná zmes sa pred použitím nariedi 2. zmieša so substrátovou DNA 3. pridá sa príslušný počet jednotiek enzýmu (1-5 U na 1 μg DNA) 4. štiepenie prebieha pri optimánej teplote po dobu 0,1 - 2 hodiny 5. po skončení reakcie sa pridá zastavovacia zmes 6. výsledok štiepenia sa vyhodnotí na základe elektroforézy v agarózovom géli - v prípade, ak sa fragmenty používajú v ďalších experimentoch (napr. v ligácii), je potrebné restrikčnú endonukleázu po skončení štiepenia inaktivovať - tepelná inaktivácia sa robí zohriatím na teplotu 60 - 80 °C počas 5 až 15 min, pričom podmienky závisia od stability restrikčnej endonukleázy - v niektorých prípadoch je nutné z reakčnej zmesi enzým odstrániť (najčastejšie purifikáciou na kolónke) - po skončení štiepenia sa priebeh reakcie overí elektroforézou v agarózovom géli

Aká môže byť rozoznávacia sekvencia?

a. jednoznačná - identita všetkých nukleotidov je presne určená b. nejednoznačná - v niektorých polohách môžu byť rôzne nukleotidy, napr. GT(A/C)(G/T)AC - v iných prípadoch je palindomatická rozoznávacia sekvencia prerušená niekoľkými náhodnými nukleotidmi, napr. GCANNNNNTGC - najčastejší výskyt majú restrikčné endonukleázy s rozoznávacou sekvenciou dlhou 4 alebo 6 nukleotidov

Od čoho závisí rýchlosť pohybu DNA v agarózovom géli?

1. od veľkosti molekuly - molekuly lineárnej dvojvláknovej DNA sa pohybujú rýchlosťou, ktorá je závislá od prevrátenej hodnoty logaritmu molekulovej hmotnosti - na základe tejto vlastnosti je možné určiť veľkosť neznámych fragmentov DNA porovnaním s pohyblivosťou štandardov molekulovej hmotnosti (tzv. DNA ladder). - rýchlosť pohybu nezávisí od náboja, pretože všetky molekuly DNA majú rovnaký náboj na jednotku hmotnosti (fosfát/nukleotid) 2. od tvaru molekuly - pri delení plazmidov má najväčšiu pohyblivosť superšpiralizovaná kruhová forma DNA - lineárna DNA a otvorená kruhová forma sa pohybujú pomalšie 3. od koncentrácie agarózového gélu - polysacharidové vlákna agarózy vytvárajú v agarózových géloch sieť - medzi vláknami zostávajú medzery - póry, ktoré umožňujú prechod molekúl DNA počas elektroforézy - veľkosť pórov je závislá od koncentrácie agarózy: čím je koncentrácia vyššia, tým je gél vhodnejší na delenie menších molekúl 4. od napätia - čím je napätie vyššie, tým rýchlejšie prebieha separácia, zároveň sa uvoľňuje viac tepla, ktoré zohrieva aparatúru a môže interferovať (stretnúť, krížiť?) s delením - optimálny potenciálový spád v horizontálnej elektroforetickej aparatúre je približne 5 V/cm

Zloženie nanášacej farbičky?

10mM TrisHCl, ph 7, 6 10mM EDTA 0,05% brómfenol. modrá 0,05% xylén cyanol 50% glycerol

Nukleázy

hydrolyzujú NK a) DNázy b) RNázy jednovláknové, dvojvláknové endo, exo

DNA ligáza?

katalyzuje vytvorenie KOVALENTNEJ väzby medzi 3OH a 5P koncom dvojvláknovej DNA - využitie pri tvorbe rekombinantnej DNA pri spájaní komplementárnych koncov vytvorených štiepením RE

Aké sú podmienky štipenia DNA pomocou RE?

o pH prostredia - zabezpečené vhodným tlmivým roztokom - najčastejšie sa používa 10 - 100 mM TrisHCl, ktorý má pH = 7,6 - 8,0 o koncentrácia Mg2+ iónov - najčastejšie v rozmedzí 5 - 10 mM o iónová sila - reakčná zmes obsahuje 50 - 150 mM NaCl alebo KCl o prítomnosť stabilizátorov - napr. sérový albumín (0,1 mg/ml BSA), ditiotreitol, TritonX100 o teplota - 25 - 65°C, najčastejšie 37°C

Čo je dôležité pre úspech experimentov pri klonovaní a čo sa v reakcii nesmie nachádzať?

o vysoká kvalita enzýmov o čistota použitej DNA - v reakcii sa nesmú nachádzať: o stopy nešpecifických nukleáz, ktoré spôsobujú degradáciu DNA o iné prímesy (napr. alkohol, SDS, fenol), ktoré inhibujú aktivitu restrikčnej endonukleázy

Alkalická fosfatáza

odstraňuje 5 fosfátovú skupinu z konca DNA/RNA - pri defosforylácii vektora pred ligáciou + na defosforyláciu pred značeníjm DNA

Aké poznáme elektorforetické gély a aká je ich úloha?

Úloha: zabezpečiť delenie molekúl podľa veľkosti - vo voľnom roztoku putujú DNA molekuly rovnakou rýchlosťou (všetky majú rovnaký fosfát. zvyšok v každom nukleotide) a) AGARÓZOVÝ GÉL - delenie veľkých molekúl nukleových kyselín - tvorený komplexom polymérnych vlákien, agarom - putovanie DNA v elektrickom poli obmedzené rýchlosťou prestupu dlhej vláknitej molekuly cez póry gélu - rýchlosť pohybu závisí od veľkosti molekuly - fragmenty DNA rovnakej dĺžky postupujú rovnako rýchlo a v géli vytvoria prúžok b) POLYAKRYLAMIDOVÝ GÉL - zložený z rôznych koncentrácii akrylamidu (prudko toxický) a sieťovacích vlákien - využíva sa pri elektroforéze na analýzu malých molekúl DNA alebo RNA - úlohou je zabezpečiť delenie molekúl podľa veľkosti, pretože vo voľnom roztoku putujú molekuly DNA rovnakou rýchlosťou (všetky majú rovnaký fosfátový zvyšok v každom nukleotide)

Reakčná zmes pre štiepenie EcoRI (pufor Promega H)?

500 mM NaCl 900 mM TrisHCl ph = 7,5 100 mM MgCl2

Čo sú restrikčné endonukleázy?

Enzýmy, súčasť restrikčno-modifikačného systému bakteriálnych buniek, ktorého úlohou je chrániť hostiteľskú bunku pred vstupom cudzorodej DNA pri fágovej infekcii - v hosteľských bunkách sa vyskytujú spolu s partnerským enzýmom - DNA metylázou - štiepia dvojvláknovú DNA v presne definovanej rozoznávacej (cieľovej) sekvencii - skladá sa najčastejšie zo 4-8 nukleotidov, ktoré majú palindromatickú symetriu - palindróm - sekvencia, ktorá má rovnaký zmysel v oboch smeroch - je to susediaca obrátená repetícia - nukleotidová sekvencia, ktorá sa opakuje na rovnakom reťazci vo svojej komplementárnej podobe a na komplementárnom vlákne v protismere) - symetria rozoznávacej sekvencie je spôsobená tým, že restrikčné endonukleázy sa viažu na DNA ako diméry

T4 polynukleotid kináza

- pridáva fosfát. skupinu na 5-hydroxylový koniec molekuly DNA + RNA - potrebná pri fosforylácii linkerov + adaptérov pred ligáciou + pri rádioaktívnom značení fragmentov DNA na 5-konci

Čo sú to fluorescenčné farbivá?

- využívajú sa na vizualizáciu fragmentov - špecificky vyfarbujú DNA v agarózovom géli - ETHIDIUMBROMID (EtBr) - vloží sa do vnútra dvojzávitnice medzi párujúce sa dusíkaté bázy; po ožiarení UV oranžovo fosforeskuje: karcinogénny - SybrGreen, I, DsRed, GelRed - iné farbivá s nižšou toxicitou

Aké typy E poznáme?

I. Elektroforéza v agarózovom géli - na delenie molekúl nukleových kyselín - robí sa v horizontálnej elektroforetickej aparatúre (tzn. vodorovne s povrchom stola) II. Elektroforéza v polyakrylamidovom géli (PAGE) - pre analýzu malých molekúl DNA alebo RNA - beží vo vertikálnej elektroforetickej aparatúre (tzn. kolmo na povrch stola)

Reverzná transkriptáza

RNA závislá DNA polymeráza - prepisuje RNA templát za vzniku DNA; na prípravu komplementárnej DNA (cDNA) z templátu RNA pre účely klonovania/pri stanovení gén. expresie

Zloženie TAE

Tris báza, kys. octová, EDTA